Tack för att du besöker Nature.com.Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd.För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer).Under tiden, för att säkerställa fortsatt support, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Cancerceller har utvecklat olika mekanismer för att övervinna cellulär stress och fortsätta att utvecklas.Proteinkinas R (PKR) och dess proteinaktivator (PACT) är de initiala svararna som övervakar olika stresssignaler som leder till hämning av cellproliferation och apoptos.Regleringen av PACT-PKR-vägen i cancerceller är dock i stort sett okänd.Här fann vi att lång icke-kodande RNA (lncRNA) aspartyl tRNA-syntetas antisense RNA 1 (DARS-AS1) är direkt involverad i hämningen av PACT-PKR-vägen och främjar cancercellsproliferation.Genom att använda storskalig funktionell screening av CRISPRI 971 cancerassocierad lncRNA fann vi att DARS-AS1 var associerad med signifikant förbättrad cancercellsproliferation.Därför hämmar DARS-AS1 knockout cellproliferation och främjar cancercellapoptos i olika cancercellinjer in vitro och minskar signifikant tumörtillväxt in vivo.Mekaniskt binder DARS-AS1 direkt till PACT-aktiveringsdomänen och förhindrar PACT-PKR-interaktion, vilket minskar PKR-aktivering, eIF2α-fosforylering och hämmar apoptotisk celldöd.Kliniskt uttrycks DARS-AS1 brett i flera cancerformer, och överuttryck av detta lncRNA tyder på en dålig prognos.Denna studie belyser cancerspecifik reglering av PACT-PKR-vägen av DARS-AS1 lncRNA och ger ett annat mål för cancerprognos och behandling.
Förmågan att anpassa sig till stress är en viktig egenskap för cancercellers överlevnad och proliferation.Den snabba spridningen och metaboliska kännetecknen för cancer toppar i hårda mikromiljöer - näringsbrist, hypoxi och lågt pH - som kan utlösa signalvägar för celldöd.Dysregulering av stresskänsliga gener såsom p535, värmechockproteiner 6, 7, KRAS8, 9 och HIF-110, 11, 12, 13 observeras ofta i cancer, vilket blockerar apoptos och främjar överlevnad.
Proteinkinas R (PKR) är en viktig stresssensor och subenhetkinas av eukaryot initieringsfaktor 2α (eIF2α), en translationsregulator som kopplar cellulär stress till celldöd.PKR identifierades ursprungligen som ett antiviralt protein genom detektering av ett främmande dubbelsträngat RNA (dsRNA).Vid aktivering fosforylerar PKR eIF2α för att hämma viral och cellulär proteinsyntes14,15,16.PACT (PKR-aktivatorprotein) har identifierats som det första PKR-aktivatorproteinet i frånvaro av dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Genom direkt interaktion med PKR omvandlar PACT olika påfrestningar (serumsvält, peroxid- eller arsenitbehandling) till PKR och nedströms signalvägar.Förutom eIF2α-fosforylering utlöser PACT-medierad PKR-aktivering olika händelser associerade med stressresponsen, inklusive förändrad redoxstatus via PI3K/Akt24-vägen, förbättrad DNA-skadekontroll via p5325,26 och NF-κB27,28 Reglerar transkription, 29. Med tanke på deras avgörande roll i stressrespons, spridning, apoptos och andra viktiga cellulära processer är PKR och PACT lovande terapeutiska mål för många sjukdomar, särskilt cancer30,31,32,33.Men trots denna pleiotropa funktionella och biologiska betydelse förblir regleringen av PACT/PKR-aktivitet i cancerceller svårfångad.
lncRNA är transkript som är större än 200 nukleotider utan proteinkodande potential.Sedan banbrytande projekt för sekvensering av hela genomet har identifierat tusentals lncRNA,35,36 har mycket ansträngning gjorts för att belysa deras biologiska funktioner.En växande mängd forskning har visat att lncRNA är involverade i många biologiska processer37 inklusive regleringen av X-kromosominaktivering38,39, imprinting40, transkription41,42, translation43 och till och med cancertillväxt44,45,46,47.Dessa studier rapporterade att många lncRNA är involverade i PACT/PKR-vägen.En sådan studie visade att lncRNA ASPACT hämmade PACT-transkription och ökade nukleär retention av PACT-mRNA.Andra studier har visat att lncRNA nc886 binder till PKR och hämmar dess fosforylering49,50.Hittills har lncRNA som reglerar PACT-medierad PKR-aktivering inte rapporterats.
Aspartyl-tRNA-syntetas-antisens-RNA 1 (DARS-AS1) har identifierats som ett onkogent lncRNA51,52,53,54.Genom regleringen av miP-194-5p53, miP-12952 och miP-532-3p51 har DARS-AS1 visat sig främja tillväxten av klarcellig njurcellscancer, sköldkörtelkarcinom respektive icke-småcellig lungkarcinom.Tong och kollegor fann också att DARS-AS1 främjar myelomprogression genom att bibehålla stabiliteten hos protein 39 (RBM39) RNA-bindande motiv.Emellertid har inga studier utförts på huruvida detta lncRNA är involverat i regleringen av PACT-PKR-aktivering och stressresponsen hos cancerceller.
Här utförde vi en storskalig funktionsförlustskärm med hjälp av CRISPRI-systemet och fastställde att DARS-AS1 lncRNA främjar spridningen av flera typer av cancerceller.Dessutom har vi identifierat en viktig mekanism: DARS-AS1 binder direkt till PACT, hämmar PACT- och PKR-bindning, förhindrar fosforylering av eIF2α, ett lägre PKR-substrat, och hämmar slutligen apoptotisk celldöd.Sammanfattningsvis avslöjar vårt arbete DARS-AS1 lncRNA som en regulator av PACT-PKR-vägen och ett potentiellt mål för cancerbehandling och prognos.
Omfattande genomiska profileringsstudier har identifierat hundratals lncRNAs associerade med cancer.Deras funktion är dock i stort sett okänd56.För att identifiera lovande lncRNA-kandidater involverade i cancerprogression utförde vi en funktionsförlustskärm för minskad spridning i SW620-kolorektalcancercellinjen med hjälp av CRISPRi-systemet (Fig. 1a).Den unika egenskapen hos koloncancercellinjerna SW480 och SW620 är att de härrör från primära och sekundära tumörer hos en enda patient.Detta ger en värdefull jämförelse för att studera genetiska förändringar i utvecklingen av avancerad tjocktarmscancer.Därför analyserade vi transkriptomerna av kolorektala cancercellinjer (SW480 och SW620) med hjälp av RNA-sekvensering och samlade in några potentiella funktionella lncRNA från den publicerade litteraturen.Baserat på dessa resultat designade vi ett poolat sgRNA-bibliotek innehållande 7355 sgRNA-oligo som riktade in sig på 971 cancerassocierade lncRNA:er och 500 oriktade sgRNA-oligo för en negativ kontroll (kompletterande data 1).
Schematisk representation av screening med CRISPRi-systemet.b sgRNA-anrikning efter screening.Den horisontella streckade linjen representerar log2 (veckändring) = ±0,58.Den vertikala streckade linjen indikerar p-värde = 0,05.Svarta prickar representerar icke-mål-sgRNA (betecknat som NC).Röda prickar är sgRNA som riktar sig mot DARS-AS1.Blå prickar är sgRNA som riktar sig till LINC00205, ett tidigare beskrivet onkogent lncRNA.veckförändring = (normaliserad avläsning, dag 17)/(normaliserad avläsning, dag 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown hämmade celltillväxt.Felstaplar representerar ± standardavvikelse för de tre experimenten.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 tvåsidigt Students t-test.d DARS-AS1 uttryck i tumörer (TCGA dataset).em Uttryck av DARS-AS1 i parade normala och tumörprover från patienter med BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP respektive COAD (TCGA-dataset).p-värden erhölls med hjälp av parat tvåsidigt Students t-test.
Efter att ha konstruerat plasmiden och packat lentiviruset transducerade vi dCas9-SW620 kolorektal cancercellinje med ovanstående bibliotek i fyra oberoende infektionsexperiment.Infektionsmångfalden (MOI) för dessa infektioner var 0,1–0,3, vilket indikerar att varje cell endast kan transfekteras med ett sgRNA.Efter 18 dagars in vitro-odling minskade eller ökade anrikningsprofilen för mål-sgRNA efter screening, medan antalet icke-målinriktade kontrolloligonukleotider förblev relativt oförändrat jämfört med pre-screeningsprofilen, vilket indikerar att vårt mål har en mycket screen-specifik bibliotek.Ris.1b och tilläggstabell 1). LINC00205, som tidigare rapporterats främja lungcancer och levercancerprogression58,59,60, screenades bort (log2 (foldchange) <-0,58, p-värde <0,05), vilket bekräftar tillförlitligheten av denna screening (Fig. 1b). LINC00205, som tidigare rapporterats främja lungcancer och levercancerprogression58,59,60, screenades bort (log2 (foldchange) <-0,58, p-värde <0,05), vilket bekräftar tillförlitligheten av denna screening (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, som tidigare rapporterats främja utvecklingen av lungcancer och levercancer58,59,60, exkluderades (log2 (faldig förändring) <-0,58, p-värde <0,05), vilket bekräftar robustheten av denna screening (Fig. .1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, som tidigare rapporterats främja lung- och levercancerprogression58,59,60, exkluderades (log2 (faldig förändring) <-0,58, p-värde <0,05), vilket bekräftar robustheten i denna screening (Fig. .1b).
Bland alla lncRNA som testades screenades även DARS-AS1, med de tre besläktade sgRNA-oligonukleotiderna signifikant reducerade efter 18 dagars odling, vilket tyder på att nedbrytning av detta lncRNA resulterade i minskad cancerproliferation (Fig. 1b).Detta resultat stöddes ytterligare av MTS-analys i kolorektala cancerceller som visade att tillväxthastigheten för DARS-AS1 knockdown-celler endast halverades jämfört med kontrollceller (Figur 1c) och överensstämde med tidigare rapporter om flera andra cancertyper.: klarcellig njurcancer, sköldkörtelcancer och icke-småcellig lungcancer51,52,53,55.Men dess funktion och molekylära mekanismer i kolorektal cancer förblir outforskade.Därför valde vi detta lncRNA för vidare studier.
För att studera DARS-AS1-uttryck hos patienter analyserade vi omfattande 10 327 tumörprover från projektet Cancer Genome Atlas (TCGA).Våra resultat visar att DARS-AS1 är brett uttryckt och signifikant uppreglerad i friska celler i en mängd olika tumörer, inklusive kolonadenokarcinom (COAD), renal clear cell carcinom (KIRC) och renal papillary cell carcinoma (KIRP)..Mycket få (fig. Id och kompletterande fig. la, b). Analys av parade friska/tumörprover bekräftade ytterligare ett signifikant högre uttryck av DARS-AS1 i tumörer av urinblåsan urotelial carcinom (BLCA), renal renal clear cell carcinoma (KIRC), prostata adenocarcinom (PRAD), lung skivepitelcancer (LUSC) , uterus corpus endometriecarcinom (UCEC), lungadenokarcinom (LUAD), leverhepatocellulärt karcinom (LIHC), njurpapillärcellscancer (KIRP) och kolonadenokarcinom (COAD) (p-värde < 0,05) (Fig. 1e–m) . Analys av parade friska/tumörprover bekräftade ytterligare ett signifikant högre uttryck av DARS-AS1 i tumörer av urinblåsan urotelial carcinom (BLCA), renal renal clear cell carcinoma (KIRC), prostata adenocarcinom (PRAD), lung skivepitelcancer (LUSC) , uterus corpus endometriecarcinom (UCEC), lungadenokarcinom (LUAD), leverhepatocellulärt karcinom (LIHC), njurpapillärcellscancer (KIRP) och kolonadenokarcinom (COAD) (p-värde < 0,05) (Fig. 1e–m) .Analys av parade friska/tumörprover bekräftade också signifikant högre uttryck av DARS-AS1 i urinblåsa-urothelial carcinom (BLCA), clear cell renal and renal cell carcinom (KIRC), prostataadenocarcinom (PRAD), lung skivepitelcancer (LUSC) tumörer., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , endometriekarcinom i corpus uteri (UCEC), adenokarcinom i lungan (LUAD), hepatocellulärt leverkarcinom (LIHC), papillärcellscancer i njuren (KIRP) och adenokarcinom i tjocktarmen (COAD) (p-värde < 0,05) (Fig. 1e– m) .配对健康/肿瘤样本的分析进一步证实了DARS-AS1 在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、肾肾透明细胞癌(KIRC)、前列腺腺癌(PRAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC) 肿瘤中的显着 更 高 表达 ← 子宫体子宫 癌 癌 癌 （（UCEC） ， 肺腺癌 （LUAD） ， 肝肝 细胞癌 （LiHC） ， 肾 乳头状 细胞癌 （KIRP） 和结肠腺癌 （COAD） 细胞癌 （值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值 值. <0,05）（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 DARS-OS1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (Prad) 、 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌(lUSC) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 表达 ， 内膜 癌 （（ucel） 肺腺癌 （LUAD） 肝肝 细胞癌 （更 高 高 ， 肾 乳头状 癌 乳头状 细胞 细胞 细胞 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 （肺腺癌 肝肝 细胞癌 细胞癌 （（（更 高 高 肾 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 肺腺癌 肺腺癌 肺腺癌 （肝肝 肝肝 细胞癌 （（（更 高 高 肾 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞.癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Analys av friska/tumörparade prover stödde ytterligare rollen av DARS-AS1 i urinblåsauroteliala carcinom (BLCA), klarcellig njurcellscancer (KIRC), prostataadenokarcinom (PRAD) och lungskivepitelcancer (LUSC) tumörer.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). uttryck i corpus livmoderkarcinom (UCEC), lungadenokarcinom (LUAD), hepatocellulärt karcinom (LIHC), njurpapillärcellscancer (KIRP) och kolonadenokarcinom (COAD) (p-värde <0,05) (Figur 1e -m).Sammantaget indikerar dessa resultat att DARS-AS1 är brett och starkt uttryckt i en mängd olika cancerformer.
Eftersom DARS-AS1 och DARS (genen som kodar för antisenssträngen) delar samma promotor och är placerade bredvid varandra, designade vi shRNA för att specifikt slå ner DARS-AS1 men inte DARS (tilläggsbild 2a,b och tilläggstabell 2). .Förutom SW620 använde vi också tre andra cellinjer som starkt uttrycker DARS-AS1 för att studera effektiviteten och funktionen av shRNA knockdown (kompletterande tabell 3).Våra resultat visade att alla tre utvecklade shRNA uppnådde minst 80% DARS-AS1 knockdown effektivitet med liten effekt på mängden DARS mRNA (kompletterande Fig. 2c-f).Dessutom fann vi att DARS-AS1 knockdown med dessa shRNA signifikant hämmade celltillväxt i kolorektala cancercellinjer SW620 (49,7%) och HCT116 (27,7%), bröstcancercellinje MBA-MD-231 (53,4%).) och HepG2-hepatomcellinjen (92,7 % minskning), såväl som deras förmåga att bilda oförankrade sfärer (genomsnittlig minskning på ~50,8 %, 44,6 %, 40,7 % och 75,7 % per cellinje) (Fig. 2a,b).I SW620 bekräftade resultaten av kolonibildningsanalysen ytterligare att DARS-AS1 shRNA signifikant hämmade cellproliferation med en genomsnittlig minskning på cirka 69,6% (Fig. 2c).
Effekt av kontroll shRNA och DARS-AS1 shRNA på cellproliferation (a) och sfäroidbildning (b) i SW620, HCT116, MBA-MD-231 och HepG2 celler.c Effekt av kontroll-shRNA och DARS-AS1-shRNA på kolonibildning i SW620-celler.Cellproliferation (d), sfäroidbildning (e) och kolonibildning (f) av SW620-celler som överuttrycker DARS-AS1.Data som visas är medelvärdet ± standardavvikelsen för tre experiment.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 och *** p ≤ 0,001 med tvåsidigt Students t-test.
För att komplettera studier med förlust av funktion skapade vi nästa SW620-celler som överuttrycker DARS-AS1 (kompletterande fig. 2g).DARS-AS1-överuttryck ökade signifikant celltillväxt (1,8-faldigt), oförankrad sfäroidbildning (1,4-faldigt) och kolonibildning (3,3-faldigt) i SW620-celler (Fig. 2d-f).Vi bekräftade detta resultat med en annan DARS-AS1-uttryckande cellinje, A549.Denna ökade cellproliferation på grund av DARS-AS1-överuttryck observerades ytterligare i A549-celler (kompletterande fig. 2h, i och kompletterande tabell 3).Sammantaget visar dessa vinst- och förluststudier att DARS-AS1 främjar cancercellsproliferation in vitro.
För att utforska den underliggande mekanismen genom vilken DARS-AS1 reglerar cellproliferation, utförde vi en RNA-neddragningsanalys för att identifiera dess potentiella proteinbindande partner.RT-qPCR-resultat visade att cirka 86,2 % av DARS-AS1 finns i cytoplasman hos SW620-celler (kompletterande figur 3a).Den in vitro transkriberade biotinylerade DARS-AS1 eller pseudoRNA inkuberades sedan med SW620-cellysat följt av SDS-PAGE-separation.Efterföljande silverfärgning visade att ett distinkt band (~ 38 kDa) var signifikant berikat i DARS-AS1-dragprover men inte i prover av dummy-RNA eller pärlor (Fig. 3a).Detta band identifierades som ett PKR-aktiverande protein (PACT) genom masspektrometri (MS) och bekräftades ytterligare genom immunblotting i SW620-, HCT116- och HepG2-cellinjer (Fig. 3a,b).Anrikningen av DARS och relaterade PACT-proteiner – PKR och TRBP – undersöktes också med hjälp av RNA-analys genom Western blotting (WB).Resultaten visade att ingen direkt interaktion mellan DARS-AS1 RNA och dessa tre proteiner hittades (kompletterande fig. 3b).Den specifika interaktionen mellan DARS-AS1 och PACT bekräftades ytterligare av RNA-immunutfällningsanalys (RIP), som visade att DARS-AS1 var signifikant berikad i anti-PACT-antikroppar men inte andra kontroll-RNA (Figur 3c).För att bestämma om DARS-AS1 interagerar direkt med PACT i frånvaro av några andra cellulära komponenter, utfördes en in vitro biolagerinterferometri (BLI) analys med renat PACT.Biotinmärkt DARS-AS1 eller dummy RNA immobiliserades på streptavidin (SA) biosensorer och inkuberades sedan i kinetisk buffert innehållande 1 μM PACT.Noterbart band PACT starkt till DARS-AS1 (KD-värde ~26,9 nM), men inte för att efterlikna RNA (Figur 3d).Sammantaget visar dessa resultat en direkt interaktion och hög affinitet mellan DARS-AS1 och PACT.
RNA-pullanalys identifierade DARS-AS1 som interagerar med PACT i SW620-celler.Ovan, silverfärgning av relaterade proteiner.Lägre immunoblots utfördes med anti-PACT-antikropp.b RNA-neddragningsanalys utfördes i HCT116 (överst) och HepG2 (botten) celler.PACT-anrikning detekterades genom immunblotting.cRNA-immunutfällningsanalyser (RIP) utfördes i SW620-celler med användning av de angivna antikropparna.d PACT-bindningskurvor till DARS-AS1 eller kontroll-RNA i full längd erhölls med användning av bioskiktsinterferometri (BLI).RNA immobiliserades på en streptavidinbiosensor.1 μM PACT användes för att mäta association.RNA-pull-analysen utfördes med biotinylerad fullängds DARS-AS1 eller trunkerad (överst).Immunoblot som visar PACT mottagen (nederst).f Renad flaggad PACT inkuberades med biotinylerad fullängds DARS-AS1 eller trunkerades (som i e) för in vitro RIP-analys.Det extraherade RNA:t verifierades med RT-qPCR.g Den relativa affiniteten för olika RNA-fragment för PACT erhölls med användning av biolagerinterferometri.För analys användes 100 nM RNA och 1 μM RAST.h In vitro RIP-analyser utfördes med användning av renad intakt eller trunkerad märkt PACT.Det extraherade RNA:t verifierades med RT-qPCR.i Tillväxthastighet för SW620-celler som överuttrycker DARS-AS1, PACT eller båda.j Överuttryck av fullängds eller trunkerad DARS-AS1 i SW620-celler hade olika effekter på celltillväxt.k Apoptos detekterades genom immunblotting med anti-PARP-antikropp.l Knockout av DARS-AS1 inducerar apoptos av SW620-celler som visas med flödescytometri.Data som visas är medelvärdet ± standardavvikelsen för tre experiment. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, genom tvåsidigt Students t-test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, genom tvåsidigt Students t-test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 med tvåsidigt Students t-test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 med tvåsidigt Students t-test.
Vi genererade sedan tre biotinylerade DARS-AS1-RNA-fragment genom in vitro-transkription för att identifiera DARS-AS1-regionen som krävs för PACT-association (Figur 3e).RNA-analysresultaten visade att varje fragment kunde interagera med PACT, men den 3'-terminala regionen (384–768 nukleotider märkta A3) visade mer än 1–384 nukleotider märkta A1) (Fig. 3e).Liknande resultat observerades i in vitro RIP-analysen med användning av rekombinant PACT (Figur 3f).I enlighet med dessa resultat visade experiment för att binda immobiliserade RNA-fragment till PACT med BLI också att PACT har en högre affinitet för A3 (384–768 nt) (KD-värde på cirka 94,6 nM), medan nästan inga kopplingar till andra områden.(Fig. 3d).
Vi undersökte också de associerade bindande regionerna i PACT.PACT innehåller tre funktionella domäner, varav två är konserverade dubbelsträngade RNA-bindande domäner (dsRBD) och en tredje domän (betecknad D3) som fungerar som en aktivator av proteininteraktioner.För att undersöka lncRNA-bindningskapaciteten för varje domän, konstruerade vi tre mutationer som tog bort var och en av de tre domänerna och utförde en in vitro RIP-analys.Våra resultat visade att deletion av den tredje domänen (D3) av PACT signifikant minskade dess interaktion med DARS-AS1 (med 0,11 gånger jämfört med intakt PACT) jämfört med de andra två mutationerna (Fig. 3h), det visades att frisättningen av D3 interagerade med DARS.-AC1.Sammantaget tyder dessa resultat på att interaktion mellan DARS-AS1 och PACT främst kan ske genom 3′-änden av DARS-AS1 och D3-domänen av PACT.
Vi noterade att DARS-AS1 inte hade någon effekt på PACT-uttryck och PACT hade ingen effekt på DARS-AS1 (kompletterande Fig. 3c).Vi undersökte sedan effekten av PACT knockdown på celltillväxt.I motsats till DARS-AS1 växte relativa celler 1,5–3 gånger snabbare när PACT slogs ner (kompletterande fig. 3d).Resultaten av kolonibildningsanalysen indikerade att cellerna bildade 2-3-faldiga kolonier efter shRNA-behandling med PACT (kompletterande fig. 3e).För att testa om DARS-AS1 reglerar cellproliferation genom PACT, genererade vi SW620-celler som överuttrycker PACT, DARS-AS1 eller båda.Överuttryck av PACT visade signifikant hämning av cellproliferation (Figur 3i).Medan DARS-AS1-överuttryck i sig avsevärt främjade cellproliferation, fanns det ingen signifikant skillnad i tillväxthastigheten för celler som överuttrycker DARS-AS1 och PACT.Dessa resultat tyder på att PACT kan motverka den ökade spridningen som orsakas av DARS-AS1-överuttryck.
Eftersom olika regioner av DARS-AS1 har olika PACT-bindande förmågor, undersökte vi deras relativa inflytande på cellproliferation genom olika överuttryck av DARS-AS1-fragment.Jämfört med de andra två fragmenten överuttrycktes DARS-AS1 i 3′-änden (384–768 nt), den huvudsakliga PACT-relaterade regionen i DARS-AS1, som hade den högsta förmågan att stimulera cellproliferation (Fig. 3j).Dessa resultat indikerar en positiv korrelation mellan bindningskapaciteten och den biologiska funktionen hos DARS-AS1.
PACT har rapporterats vara ett pro-apoptotiskt protein19.Därför undersökte vi effekten av DARS-AS1 på apoptos.Som väntat ökade DARS-AS1 knockdown signifikant PARP-klyvning i SW620-celler och ökade andelen annexin V-positiva celler i SW620, HCT116, HepG2 och MBA-MD-231 cellinjer (Fig. 3k).3).3f–h), vilket indikerar att den anti-apoptotiska effekten av DARS-AS1 i cancerceller är motsatt den apoptosinducerande funktionen hos PACT.Sammantaget tyder dessa resultat på att mekanismen för DARS-AS1 onkogen funktion kan vara genom hämning av PACT-funktionen.
Därefter undersökte vi de funktionella implikationerna av DARS-AS1-PACT-föreningen.PACT har rapporterats aktivera PKR genom direkt interaktion, vilket därefter förbättrar eIF2α-fosforylering, vilket orsakar translationell deletion och apoptos17.Först undersökte vi om DARS-AS1 påverkar den cellulära lokaliseringen av PACT och PKR.Konfokal fluorescensmikroskopi visade att PACT och PKR var starkt kolokaliserade i SW620-celler med en genomsnittlig Pearson-korrelationskoefficient på 0,72.Samtidigt reducerade DARS-AS1-överuttryck signifikant PACT- och PKR-samlokalisering (genomsnittlig Pearson-korrelationskoefficient 0,61) (Figur 4a).För att undersöka om DARS-AS1 kunde modulera PACT-PKR-interaktionen, utförde vi en co-immunoprecipitation (co-IP) analys med anti-PACT antikropp i SW620 cellysat.PKR var starkt anrikat på anti-PACT i kontrollceller, medan PKR-återvinning var signifikant reducerad i lysat från celler som överuttrycker DARS-AS1 (Fig. 4b).Renade märkta PACT och PKR användes för in vitro proteinbindningsanalyser.Följaktligen visade de som gav DARS-AS1 men inget kontroll-RNA undertryckt PACT-PKR-interaktion (Figur 4c).Alla resultat visade att DARS-AS1 störde PACT- och PKR-kommunikationen.
en samlokalisering av PACT och PKR i kontrollceller eller celler som överuttrycker DARS-AS1 observerades med användning av konfokal fluorescensmikroskopi.Kärnorna färgades med DAPI.Statistiska resultat erhölls från 16 fotografier.b Samimmunoutfällning (co-IP) med anti-PACT-antikropp i cellysat av kontroll SW620-celler eller celler som överuttrycker DARS-AS1.c Märkt PACT, renat PKR och transkriberat in vitro med DARS-AS1 eller sken-RNA inkuberades för in vitro proteinbindningsanalys.Anti-flagga antikroppar användes för immunoutfällning.d Immunoblots med de angivna antikropparna utfördes i SW620- och HCT116-celler transfekterade med kontroll-shRNA eller DARS-AS1-shRNA följt av serumsvält.e DARS-AS1 uttrycksnivåer förändrade cellulär känslighet för thapsigargin.SW620-celler transfekterades med DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 överuttrycksplasmid eller kontrollplasmid.Celler behandlades med thapsigargin i 48 timmar och cellviabiliteten bestämdes med användning av MTS-reagenset.f In vitro transkriberad DARS-AS1 eller dummy RNA och renat PACT användes för in vitro aktiveringsanalys och immunoblotdetektion.g Immunoblots med användning av dessa antikroppar utfördes på SW620-ctrl-celler (vänster) eller celler som överuttrycker PKR-mutanter (höger).Dessa celler transfekterades sedan med kontroll-shRNA eller DARS-AS1-shRNA följt av serumsvält.h Flödescytometri visade att inaktivering av mutant PKR kompenserade för DARS-AS1-inducerad apoptos i SW620-celler.i Immunoblots med de angivna antikropparna utfördes i SW620 (vänster) eller HCT116 (höger) celler.Celler transfekterade med kontroll-shRNA eller DARS-AS1-shRNA är serumberövade och kompletteras med 100 nM PKR C16-hämmare eller DMSO.Skalstång = 5 µm.Data som visas är medelvärdet ± standardavvikelsen för tre experiment.* p ≤ 0,05 tvåsidigt Students t-test.
Det antas allmänt att när PACT väl interagerar med PKR17 kan PKR-fosforylering vid Thr451 induceras.Våra resultat indikerade att nivån av PKR-fosforylering var signifikant förhöjd i DARS-AS1 knockdown-celler efter serumsvält (Fig. 4d och Kompletterande Fig. 4a).Följaktligen fann vi att fosforylering av eIF2α, det huvudsakliga PKR-substratet, också ökade signifikant av DARS-AS1 shRNA (fig. 4d och kompletterande fig. 4a).Thapsigargin är en ER-stressor som får ER att frigöra Ca2+.Behandling med thapsigargin har rapporterats inducera uttryck och aktivering av PACT, som ytterligare interagerar med och aktiverar PKR, vilket leder till apoptos genom att öka eIF2α-fosforylering 18,61.Här använde vi thapsigargin som en stimulator av PACT/PKR-vägen för att undersöka om DARS-AS1 kan hjälpa celler att övervinna stress genom att hämma PACT/PKR-vägen.Vi observerade att nivån av DARS-AS1-uttryck korrelerade positivt med cellresistens mot thapsigargin.SW620-celler som överuttrycker DARS-AS1 överlevde bättre när de behandlades med thapsigargin, medan celler med DARS-AS1 knockdown blev mer mottagliga (Fig. 4e).I överensstämmelse med dessa resultat minskade DARS-AS1-överuttryck thapsigargin-inducerad PKR-fosforylering (kompletterande fig. 4b).Däremot efter thapsigargin-behandling fosforylerades PKR och eIF2α i högre utsträckning i DARS-AS1 knockdown-celler jämfört med kontrollceller (kompletterande fig. 4b).Intressant nog inducerade thapsigargin DARS-AS1-uttryck på ett dosberoende sätt, vilket kan indikera en antistressfunktion hos DARS-AS1 (kompletterande fig. 4c).Dessutom utförde vi in vitro aktiveringsanalyser för att bekräfta dessa observationer.Kortfattat renades PKR från cellysat med användning av en anti-PKR-antikropp, inkuberades sedan med rekombinant PACT och DARS-AS1 transkriberad in vitro.Efter den enzymatiska reaktionen detekterades fosfo-PKR med användning av WB.Våra resultat indikerade att PKR-fosforylering signifikant hämmades av DARS-AS1, men inte av kontroll-RNA (Figur 4f).Dessa in vitro- och in vivo-resultat tyder på att DARS-AS1 hämmar PACT-medierad PKR-aktivering.Samtidigt observerade vi också en minskning av PACT-återhämtning i närvaro av DARS-AS1 (Figur 4f).Detta resultat överensstämmer med resultaten av proteinbindningsanalysen in vitro (Figur 4c) och illustrerar återigen blockeringsfunktionen hos DARS-AS1 för PACT-PKR-association.
Ser246 och Ser287 i D3-domänen av PACT krävs för PKR-aktivering under cellulär stress.Substitution av två serinrester mot alanin gav mutant PACT (mutD), som aktiverade PKR i frånvaro av stress, och substitution av alanin (mutA) omvände protokollet.Eftersom vi har visat vikten av denna domän i direkt association med DARS-AS1, genererade vi dessa två PACT-mutanter för att testa om dessa rester också kunde vara involverade i interaktion med DARS-AS1.Intressant nog förlorade båda mutanterna förmågan att binda till DARS-AS1 (tilläggsbild 4d), vilket tyder på att PACT-proteinets fullständiga struktur kan krävas för effektiv interaktion med DARS-AS1.
Dessutom tyder våra resultat också på att DARS-AS1-shRNA-inducerad hämning av cellproliferation delvis kan återställas genom att överuttrycka en dominant negativ PACT-mutant (PACTmutA) eller en dominant negativ PKR-mutant (PKRmut) (tilläggsbild 4e. e).Överuttryck av dominant-negativa PKR-mutanter reducerade PKR-fosforylering inducerad av DARS-AS1-knockdown såväl som eIF2a-fosforylering i serumberövade celler (Fig. 4g).Ännu viktigare, andelen apoptotiska celler inducerade av DARS-AS1 knockdown reducerades också i celler som överuttrycker PKRmut (fig. 4h och kompletterande fig. 4g).Hämning av PKR-kinasaktivitet försämrar också DARS-AS1-funktionen, eftersom resultat visade att DARS-AS1-knockdown sällan utlöste PKR- och eIF2α-fosforylering när celler behandlades med en PKR-specifik C16-hämmare (fig. 4i och kompletterande fig. 4h).).Sammantaget tyder våra resultat på att DARS-AS1 främjar cellproliferation, åtminstone delvis, genom att hämma PACT-medierad PKR-aktivering.
För att ytterligare utforska rollen av DARS-AS1 i tumörbildning, utförde vi in vivo-experiment med hjälp av en musxenograftmodell. Resultat visar att nedbrytning av DARS-AS1 dramatiskt minskade tumörtillväxt hos möss (p-värde <0,0001) (Fig. 5a). Resultat visar att nedbrytning av DARS-AS1 dramatiskt minskade tumörtillväxt hos möss (p-värde <0,0001) (Fig. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (sänkt p <0,0001) (5 рис.). Resultaten visar att DARS-AS1 knockdown drastiskt minskar tumörtillväxt hos möss (p-värde < 0,0001) (Figur 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（囀5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a） Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (sänkt р <0,0001) (5). Resultaten visade att DARS-AS1 knockdown signifikant minskade tumörtillväxt hos möss (p-värde <0,0001) (Figur 5a).Således, i DARS-AS1 knockdown-gruppen, var det en signifikant minskning av medeltumörvolymen med cirka 72,9 % och genomsnittlig tumörmassa med cirka 87,8 % (Figur 5b-d).Dessa resultat tyder starkt på att DARS-AS1 avsevärt kan främja tumörtillväxt in vivo.
Effekter av ad DARS-AS1 knockdown på kolorektal onkogenes hos nakna möss.Tillväxtkurvor (a), tumörstorlek (b), vikt (c) och tumörbilder (d) visas.Felstaplar representerar ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, med tvåsidigt Students t-test. n = 10. ****p < 0,0001, med tvåsidigt Students t-test. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 tvåsidigt Students t-test.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 på двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 tvåsidigt Students t-test.e Kaplan-Meier analyserade korrelationen mellan DARS-AS1 uttrycksnivåer och total överlevnad hos patienter med UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM och LGG.Höga nivåer av DARS-AS1-uttryck hos patienter var bland de översta 50 %;den låga nivån av DARS-AS1-uttryck hos patienter var i de nedersta 50 %.p-värden bestämdes med hjälp av log rank test.f Föreslagen modell där DARS-AS1 reglerar PACT-PKR-vägen och tumörtillväxt.
För att bättre förstå den kliniska effekten av DARS-AS1 undersökte vi korrelationen mellan dess uttryck och patientöverlevnad.Genom att analysera TCGA-datauppsättningen fann vi att högre DARS-AS1-uttryck var associerat med uvealt melanom (UVM), njurkromofobi (KICH), njurpapillärcellscancer (KIRP), mesoteliom (MESO), multiplex.Lägre överlevnad var signifikant associerad med glioblastommorfos (GBM) och patienter med låggradigt hjärngliom (LGG) (Figur 5e).Dessa resultat tyder på att DARS-AS1 kan spela en viktig roll i klinisk tumörprogression och kan vara en potentiell prediktiv biomarkör i flera cancerformer.
I denna studie, med hjälp av storskalig CRISPRI-funktionell screening, bestämde vi att DARS-AS1 lncRNA övervinner cancercellsstress genom att reglera två viktiga stressresponderare, PACT och PKR.Genom att interagera direkt med PACT inhiberade DARS-AS1 PACT-medierad PKR-aktivering, vilket förhindrade apoptotisk celldöd och främjade cellproliferation (Fig. 5f).Uppreglering av DARS-AS1 har observerats i flera typer av cancer, vilket tyder på att dess funktion att främja cancercellers överlevnad under stressiga förhållanden kan vara allmänt tillämplig på flera typer av cancer.
PACT har identifierats som ett PKR-aktivatorprotein, och PACT-medierad PKR-aktivering spelar en viktig roll i stressreaktioner genom att reglera transkription, translation, apoptos och andra viktiga cellulära processer62.I decennier har försök gjorts att förstå den cancerspecifika regleringen av PACT-PKR-kaskaden.Här avslöjade vår studie en annan mekanism för reglering av PACT-PKR i cancerceller genom cellulärt lncRNA DARS-AS1, som direkt binder till PACT, blockerar PACT-PKR-interaktion, hämmar PKR-aktivering och eIF2α-fosforylering, och därigenom hämmar stressinducerad apoptos och stimulera eventuell cancerproliferation.celler.Denna upptäckt kastar ljus över potentiella lncRNA-mål för cancerprognos och terapi.
Våra data visade att DARS-AS1 knockdown sensibiliserar celler för serumsvält med en signifikant ökning av fosforylerad PKR och eIF2α.Dessa resultat tyder på att DARS-AS1 främjar cancercellöverlevnad under svåra förhållanden genom att hämma PACT/PKR-aktivitet.Flera andra icke-kodande RNA, såsom ASPACT och nc886, är också involverade i PACT/PKR-axeln genom att nedreglera PACT48-mRNA eller reglera autofosforylering genom att binda till PKR49,50,64.Bland dem fungerar DARS-AS1 som en störare av PACT-PKR-föreningen.Denna studie berikar vår förståelse av PACT/PKR-axelreglering och rollen av lncRNA i stressreaktioner.
PACT innehåller tre separata domäner.Var och en av de två första dsRBD:erna är tillräckliga för att uppnå hög affinitetsbindning av PACT till PKR, medan den tredje domänen (D3) krävs för PKR-aktivering in vitro och in vivo.Vår studie visade att DARS-AS1 preferentiellt interagerar med D3-domänen (Fig. 3h).Med tanke på den stora storleken på lncRNA (768 nukleotider), kan DARS-AS1-bindning till D3 fysiskt hämma interaktionen mellan PACT-domänen av dsRBD och PKR, och därigenom blockera associationen av PACT och PKR.PACT-punktmutationer som ersatte Ser246 och Ser287 i D3 med alanin eller aspartat störde dess bindningsaffinitet för DARS-AS1, vilket pekar på vikten av D3:s övergripande strukturella och elektriska egenskaper i deras association.Ytterligare detaljer om denna mekanism kommer att krävas i framtiden, med mer exakt biokemisk analys och högupplöst PACT-strukturanalys.
Tidigare studier har rapporterat att DARS-AS1 främjar cellproliferation genom flera mekanismer51,52,53.I ett exempel observerade forskare att DARS-AS1 uppreglerade sin antisensproteinkodande DARS-gen genom att rikta in sig på miP-194-5p i njurcancerceller.Men i den aktuella studien hade DARS-AS1 knockdown liten effekt på DARS-transkription i flera typer av cancer, inklusive åtminstone kolorektal-, bröst- och levercancer.Eftersom lncRNA uppvisar cell- och vävnadsspecifika uttrycksmönster, kan funktionella mekanismer inte bevaras över cancertyper, vilket kan bidra till denna skillnad mellan våra observationer och tidigare bedömningar av olika cancerformer.Särskilda studier behövs för att klargöra de specifika mekanismerna för olika fysiologiska och patologiska processer.
En analys av kliniska data visade att DARS-AS1-uttryck i tumörer är omvänt korrelerat med cancerpatienters överlevnad, vilket understryker vikten av DARS-AS1/PACT/PKR-axeln i cancerprognos.Sammanfattningsvis visar vår studie att DARS-AS1 är en regulator av PACT/PKR-signalaxeln, främjar cancercellsproliferation och hämmar apoptos under stressresponsen, vilket ger en annan forskningslinje och är av intresse för framtida forskning om potentiella behandlingar .
Humana cellinjer SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 och HEK293T erhölls från National Cell Line Resource Infrastructure i Kina.Alla celler hölls i DMEM-medium (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) kompletterat med 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) och 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) vid 37°C, 5% CO2.inkubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flagga, Abcam (ab125243);Anti-eIF2a, Abcam (A0764));anti-eIF2a (fosfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anti-p-tubulin, CST (2128);normal mus-IgG, CST (5415S);normal kanin IgG, CST (2729S).Antikroppar späddes 1:1000 i PBST för Western blotting och 1:100 för IP.
sgRNA utvecklades med ett allmänt tillgängligt verktyg som heter CRISPR-ERA66.Vi använde standardverktygsparametrarna för sgRNA-utveckling och algoritmen beräknade sgRNA-bindningsställen i 3 kb-regionen.centrerad på TSS.Pooler av sgRNA-oligonukleotider syntetiserades vid CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) och klonades in i humaniserade pgRNA-plasmider (Addgene #44248).Totalt 12 µg poolad humaniserad pgRNA-plasmid, 7,2 µg psPAX2 (Addgene #12260) och 4,8 µg pMD2.G (Addgene #12259) samtransfekterades in i 5 x 106 HEK293T med användning av DNA-transektionsskålar 10 celler (CWBIO, Peking, Kina) enligt tillverkarens instruktioner.Virusinnehållande supernatanter uppsamlades 48 och 72 timmar efter transfektion och filtrerades genom ett 0,45 µm filter.För screening erhölls SW620-celler som uttrycker dCas9/KRAB-fusionsproteinet genom virustransduktion.Modifierade SW620-celler infekterades med virusbiblioteket i fyra oberoende infektionsexperiment vid en MOI på 0,1-0,3 och provtogs med 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) under 2 dagar.Därefter odlades celler under 18 dagar in vitro med en minsta bibliotekstäckning på 500 celler/sgRNA för screening.
Genomiskt DNA extraherades enligt instruktionerna från QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Tyskland; 51183).Totalt användes 100 μg genomiskt DNA per biologisk upprepning för att bygga upp biblioteket.sgRNA-regionen amplifierades genom två omgångar av PCR och länkades till en streckkod.
PCR-produkter renades med hjälp av NucleoSpin®-gel och PCR-reningskit (MACHEREY-NAGEL, Düren, Tyskland; 740609.250) och kvantifierades med användning av Qubit™ HS dubbelsträngat DNA-detektionskit (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
MTS-analysen användes för att mäta cellproliferation.Celler såddes i 96-brunnars plattor med en initial täthet av 2000 celler/brunn.Det relativa antalet celler mättes dagligen vid den angivna tiden under totalt 4-6 dagar.För varje brunn späddes 20 μl MTS-reagens (Promega) ut med 100 μl DMEM, inkuberades med celler i 4 timmar vid 37°C, och sedan mättes OD490.
Kapaciteten för oförankrad tillväxt upptäcktes genom att analysera bildningen av sfärer.Kortfattat odlades 2000 celler transfekterade med shRNA DARS-AS1 eller kontroll-shRNA i mikroplattor med ultralåg vidhäftning (Corning) med medium förändring var fjärde dag.Sfäroiderna räknades efter 14 dagar.500 celler transfekterade med DARS-AS1-överuttrycksplasmiden eller en kontrollplasmid användes för förstärkningsanalysen, annars var metoden oförändrad.
RNA transkriberades med användning av T7 RNA-polymeras och biotin-16-UTP (Roche 1138908910) enligt instruktionerna från Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).De primers som används här är listade i tilläggstabell 4.
Proteinkodande PACT- eller PKR-regioner klonades in i pET15b (Addgene #73619) och transformerades till BL21(DE3).Bakterierna inkuberades över natten i LB försedd med ampicillin och späddes sedan 100 gånger med färsk LB.När OD600 för mediet nådde 0,8, tillsattes 1 mM IPTG för att inducera proteinuttryck.Efter inkubation över natten med försiktig skakning (250 rpm vid 20°C), samlades cellpelleten upp genom centrifugering (4000 rpm, 10 min, 4°C).Återsuspendera cellpelleten i lysbuffert (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) och inkubera på is i 30 minuter, sonikera sedan (15 min, 5 s på/av, på is) och centrifugera (13 000 rpm).30 min, 4°C).Supernatanten laddades sedan på Ni-NTA-harts (QIAGEN) 3 gånger vid 4°C, tvättades 4 gånger med tvättbuffert (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazol, 250 mM NaCl) och eluerades 3 gånger, med totalt av 10 ml elueringsbuffert (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazol).Renat protein bestämdes med användning av WB och koncentrationen bestämdes med användning av Qubit™ proteinanalyskitet (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP-analyser utfördes som tidigare beskrivits, med modifieringar.Kortfattat lyser 1x RIP-buffert (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 % NP-40, RNasin-ribonukleasinhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteas) cytostatika 1 x 107 cocktail (Roche, 1 mM DTT) och centrifugera vid 13 000 rpm i 15 minuter vid 4 °C.Supernatanten inkuberades sedan med protein A+G magnetiska pärlor (Millipore) konjugerade med 5 μg anti-PACT-antikropp (Abeam) eller IgG (CST).Pärlorna tvättades 5 gånger med 5x RIP-buffert och digererades sedan med proteinas K (NEB).RNA extraherades med Trizol och bestämdes med RT-qPCR.Primers presenteras i tilläggstabell 5.
In vitro RIP-analysen utfördes enligt ett modifierat standard RIP-analysprotokoll.Totalt 5 pmol in vitro-transkriberat RNA späddes 1x med RIP-buffert och hybridiserades genom inkubation vid 65°C under 5 minuter följt av långsam kylning till rumstemperatur.Totalt 5 pmol av intakta eller muterade flaggmärkta PACT-proteiner renades från E. coli.Inkubera med renaturerat RNA i 2 timmar vid 4°C och följ ovanstående procedur för RIP-analys för anti-flagga IP.
För RNA-förlängningsanalys lyserades 1x107 celler med 1xRIP-buffert.Efter centrifugering vid 13 000 rpm i 15 minuter vid 4 ° C förbehandlades supernatanten med 30 μl streptavidin magnetiska pärlor (Beckman) i 2 timmar vid 4 ° C.Det renade lysatet försågs sedan med jäst-tRNA och inkuberades med 40 pmol renaturerat RNA över natten vid 4°C, sedan under ytterligare 2 timmar och 20 μl nya streptavidin-magnetiska pärlor blockerade med BSA tillsattes.Tvättsteget bestod av 4 gånger med 5x RIP-buffert och 4 gånger med 1x RIP-buffert.Motsvarande proteiner eluerades med biotin-elueringsbuffert (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotin, PMSF) och separerades på NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Efter silverfärgning (Beyotime Biotechnology) skars vissa band ut och analyserades med MS.
Co-IP-analys utfördes för att testa interaktionen mellan PACT och PKR.Kortfattat framställdes supernatantlysat genom att inkubera 1 x 107 lyserade celler i 1 x RIP-buffert följt av centrifugering vid 13 000 rpm under 15 minuter vid 4°C.Lysaten laddades med protein A + G magnetiska pärlor, konjugerades med 5 µg anti-PACT-antikropp och roterades försiktigt över natten vid 4°C.Pärlorna tvättades 3 gånger med 5xRIP-buffert, två gånger med 1xRIP-buffert och eluerades med 1xSDS-buffert.Det återvunna proteinet analyserades med SDS-PAGE-gel och detekterades med WB.
Två pmol flaggad PACT och 1 pmol PKR renades från E. coli.Späd i 1 x RIP-buffert och inkubera med 10 pmol renaturerat RNA i 2 timmar vid 4 °C.Därefter inkuberades de med protein A+G magnetisk pärlkonjugerad anti-märkt antikropp under ytterligare två timmar.Pärlorna tvättades sedan fyra gånger med 1x RIP-buffert och eluerades med 1x SDS-buffert.Den resulterande PACT och PKR detekterades av WB.
Posttid: 2022-09-23
