Nyheter

Tack för att du besöker Nature.com.Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd.För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer).Under tiden, för att säkerställa fortsatt support, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Effektiva fotosensibilisatorer är särskilt viktiga för den utbredda kliniska användningen av fototerapi.Konventionella fotosensibilisatorer lider emellertid i allmänhet av kortvåglängdsabsorption, otillräcklig fotostabilitet, lågt kvantutbyte av reaktiva syrearter (ROS) och aggregationsinducerad släckning av ROS.Här rapporterar vi en nära-infraröd (NIR) supramolekylär fotosensibilisator (RuDA) förmedlad av självmontering av Ru(II)-aren organometalliska komplex i vattenlösning.RuDA kan bara generera singlettsyre (1O2) i aggregerat tillstånd, och det uppvisar uppenbart aggregeringsinducerat 1O2-genereringsbeteende på grund av en signifikant ökning av övergångsprocessen mellan singlett-triplettsystemet.Under inverkan av 808 nm laserljus uppvisar RuDA ett 1O2 kvantutbyte på 16,4% (FDA-godkänd indocyaningrönt: ΦΔ=0,2%) och en hög fototermisk omvandlingseffektivitet på 24,2% (kommersiella guld nanorods) med utmärkt fotostabilitet.: 21,0 %, guld nanoskal: 13,0 %).Dessutom kan RuDA-NPs med god biokompatibilitet företrädesvis ackumuleras på tumörställen, vilket orsakar betydande tumörregression under fotodynamisk terapi med en 95,2% minskning av tumörvolymen in vivo.Denna aggregationsförbättrande fotodynamiska terapi tillhandahåller en strategi för att utveckla fotosensibilisatorer med gynnsamma fotofysiska och fotokemiska egenskaper.
Jämfört med konventionell terapi är fotodynamisk terapi (PDT) en attraktiv behandling för cancer på grund av dess betydande fördelar såsom noggrann spatiotemporal kontroll, icke-invasivitet, försumbar läkemedelsresistens och minimering av biverkningar 1,2,3.Under ljusbestrålning kan de fotosensibilisatorer som används aktiveras för att bilda högreaktiva syrearter (ROS), vilket leder till apoptos/nekros eller immunsvar4,5. De flesta konventionella fotosensibilisatorer, såsom kloriner, porfyriner och antrakinoner, har dock relativt kortvågig absorption (frekvens < 680 nm), vilket resulterar i dålig ljuspenetration på grund av den intensiva absorptionen av biologiska molekyler (t.ex. hemoglobin och melanin) i det synliga området6,7. De flesta konventionella fotosensibilisatorer, såsom kloriner, porfyriner och antrakinoner, har dock relativt kortvågig absorption (frekvens < 680 nm), vilket resulterar i dålig ljuspenetration på grund av den intensiva absorptionen av biologiska molekyler (t.ex. hemoglobin och melanin) i det synliga området6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. De vanligaste fotosensibilisatorerna som klorer, porfyriner och antrakinoner har dock relativt kort våglängdsabsorption (< 680 nm) vilket resulterar i dålig ljuspenetration på grund av intensiv absorption av biologiska molekyler (t.ex. hemoglobin och melanin) i det synliga området6,7.然而 ， 大多数 传统 的 光敏剂 ， 如 二 氢 卟酚 、 卟啉 和 蒽醌 ， 具有 相对 较 短 的 波长 吸收 （频率 <680 nm） ， 因此 对 生物 分子 （短 的 波长 吸收 黑色素 频率 的 吸收 吸收 ， ， ， 由于 生物 分子 （（的 波长 吸收 黑色素 频率 的 吸收 吸收 ， ， ， 由于 生物 分子 （短 的 波长 吸收 （频率 的 吸收 吸收）导致光穿透性差.然而 ， 大多数 传统 的 光敏剂 ， 二 氢 卟酚 、 卟啉 蒽醌 ， 具有 相对 较 短 的 波长 吸收 （频率 频率 <680 nm） 因此 由于 对 分子 （血红 蛋白 和 黑色素） 的 ， ， ， ， 吸收 吸收吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差。 Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. De flesta traditionella fotosensibilisatorer som klorer, porfyriner och antrakinoner har dock relativt kort våglängdsabsorption (frekvens < 680 nm) på grund av stark absorption av biomolekyler som hemoglobin och melanin vilket resulterar i dålig ljuspenetration.Synligt område 6.7.Därför är nära-infraröd (NIR) absorberande fotosensibilisatorer som aktiveras i det 700–900 nm "terapeutiska fönstret" väl lämpade för fototerapi.Eftersom nära infrarött ljus absorberas minst av biologiska vävnader kan det leda till djupare penetration och mindre fotoskada8,9.
Tyvärr har befintliga NIR-absorberande fotosensibilisatorer i allmänhet dålig fotostabilitet, låg genererande kapacitet för singletsyre (1O2) och aggregationsinducerad 1O2-dämpning, vilket begränsar deras kliniska tillämpning10,11.Även om stora ansträngningar har gjorts för att förbättra de fotofysiska och fotokemiska egenskaperna hos konventionella fotosensibilisatorer, har flera rapporter hittills rapporterat att NIR-absorberande fotosensibilisatorer kan lösa alla dessa problem.Dessutom har flera fotosensibilisatorer visat lovande för effektiv generering av 1O212,13,14 när de bestrålas med ljus över 800 nm, eftersom fotonenergin minskar snabbt i området nära IR.Trifenylamin (TFA) som en elektrondonator och [1,2,5]tiadiazol-[3,4-i]dipyrido[a,c]fenazin (TDP) som en elektronacceptorgrupp Donator-acceptor (DA) typ färger en klass av färgämnen, absorberande nära-infraröd, som har studerats omfattande för nära-infraröd bioimaging II och fototermisk terapi (PTT) på grund av deras smala bandgap.Sålunda kan färgämnen av DA-typ användas för PDT med nära-IR-excitation, även om de sällan har studerats som fotosensibilisatorer för PDT.
Det är välkänt att den höga effektiviteten av intersystem crossing (ISC) av fotosensibilisatorer främjar bildningen av 1O2.En vanlig strategi för att främja ISC-processen är att förbättra spin-orbit-kopplingen (SOC) av fotosensibilisatorer genom att introducera tunga atomer eller speciella organiska delar.Detta tillvägagångssätt har dock fortfarande vissa nackdelar och begränsningar19,20.Nyligen har supramolekylär självmontering tillhandahållit ett nedifrån och upp intelligent tillvägagångssätt för tillverkning av funktionella material på molekylär nivå,21,22 med många fördelar inom fototerapi: (1) självmonterade fotosensibilisatorer kan ha potential att bilda bandstrukturer.Liknar elektroniska strukturer med en tätare fördelning av energinivåer på grund av överlappande banor mellan byggstenar.Därför kommer energimatchningen mellan det nedre singlettexciterade tillståndet (S1) och det angränsande triplettexciterade tillståndet (Tn) att förbättras, vilket är fördelaktigt för ISC-processen 23, 24 .(2) Supramolekylär montering kommer att minska icke-strålningsavslappning baserat på den intramolekylära rörelsebegränsningsmekanismen (RIM), som också främjar ISC-processen 25, 26 .(3) Den supramolekylära sammansättningen kan skydda de inre molekylerna av monomeren från oxidation och nedbrytning, och därigenom avsevärt förbättra fotosensibilisatorns fotostabilitet.Med tanke på ovanstående fördelar tror vi att supramolekylära fotosensibiliseringssystem kan vara ett lovande alternativ för att övervinna bristerna med PDT.
Ru(II)-baserade komplex är en lovande medicinsk plattform för potentiella tillämpningar vid diagnos och terapi av sjukdomar på grund av deras unika och attraktiva biologiska egenskaper28,29,30,31,32,33,34.Dessutom ger överflödet av exciterade tillstånd och de avstämbara fotofysikalisk-kemiska egenskaperna hos Ru(II)-baserade komplex stora fördelar för utvecklingen av Ru(II)-baserade fotosensibilisatorer35,36,37,38,39,40.Ett anmärkningsvärt exempel är rutenium(II)-polypyridylkomplexet TLD-1433, som för närvarande befinner sig i kliniska fas II-prövningar som fotosensibiliserande medel för behandling av icke-muskelinvasiv blåscancer (NMIBC)41.Dessutom används metallorganiska rutenium(II)arenkomplex i stor utsträckning som kemoterapeutiska medel för cancerbehandling på grund av deras låga toxicitet och lätthet att modifiera42,43,44,45.De joniska egenskaperna hos Ru(II)-aren-organometalliska komplex kan inte bara förbättra den dåliga lösligheten av DA-kromoforer i vanliga lösningsmedel, utan också förbättra sammansättningen av DA-kromoforer.Dessutom kan den pseudooktaedriska halvsandwichstrukturen av de organometalliska komplexen av Ru(II)-arener steriskt förhindra H-aggregation av kromoforer av DA-typ, och därigenom underlätta bildningen av J-aggregation med rödförskjutna absorptionsband.Emellertid kan inneboende nackdelar med Ru(II)-arenkomplex, såsom låg stabilitet och/eller dålig biotillgänglighet, påverka den terapeutiska effektiviteten och aktiviteten in vivo hos aren-Ru(II)komplex.Emellertid har studier visat att dessa nackdelar kan övervinnas genom att inkapsla ruteniumkomplex med biokompatibla polymerer genom fysikalisk inkapsling eller kovalent konjugering.
I detta arbete rapporterar vi DA-konjugerade komplex av Ru(II)-aren (RuDA) med en NIR-trigger via en koordinationsbindning mellan DAD-kromoforen och Ru(II)-arendelen.De resulterande komplexen kan självmontera till metallosupramolekylära vesiklar i vatten på grund av icke-kovalenta interaktioner.Speciellt gav den supramolekylära sammansättningen RuDA med polymerisationsinducerade övergångsegenskaper mellan systemet, vilket signifikant ökade ISC-effektiviteten, vilket var mycket fördelaktigt för PDT (Fig. 1A).För att öka tumörackumulering och in vivo biokompatibilitet användes FDA-godkänd Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) för att kapsla in RuDA47,48,49 för att skapa RuDA-NP nanopartiklar (Figur 1B) som fungerade som en mycket effektiv PDT/dual- läge PTT proxy.I cancerfototerapi (Figur 1C) användes RuDA-NP för att behandla nakna möss med MDA-MB-231-tumörer för att studera effektiviteten av PDT och PTT in vivo.
Schematisk illustration av den fotofysiska mekanismen för RuDA i monomera och aggregerade former för cancerfototerapi, syntes av B RuDA-NPs och C RuDA-NPs för NIR-aktiverad PDT och PTT.
RuDA, bestående av TPA- och TDP-funktionalitet, framställdes enligt proceduren som visas i tilläggsfigur 1 (figur 2A), och RuDA karakteriserades av 1H- och 13C NMR-spektra, elektrosprayjoniseringsmasspektrometri och elementaranalys (kompletterande figurer 2-4 ).RuDA-elektrondensitetsskillnadskartan för den lägsta singletövergången beräknades med tidsberoende densitetsfunktionsteori (TD-DFT) för att studera laddningsöverföringsprocessen.Som visas i tilläggsfigur 5, driver elektrondensiteten huvudsakligen från trifenylamin till TDP-acceptorenheten efter fotoexcitation, vilket kan tillskrivas en typisk intramolekylär laddningsöverföring (CT).
Malms kemiska struktur B Absorptionsspektra av malm i blandningar av olika förhållanden av DMF och vatten.C Normaliserade absorptionsvärden för RuDA (800 nm) och ICG (779 nm) kontra tid vid 0,5 W cm-2 av 808 nm laserljus.D Fotonedbrytningen av ABDA indikeras av RuDA-inducerad bildning av 1O2 i DMF/H2O-blandningar med olika vattenhalter under inverkan av laserstrålning med en våglängd på 808 nm och en effekt på 0,5 W/cm2.
Sammanfattning - UV-synlig absorptionsspektroskopi användes för att studera självmonteringsegenskaperna hos malm i blandningar av DMF och vatten i olika förhållanden.Såsom visas i fig.2B, RuDA uppvisar absorptionsband från 600 till 900 nm i DMF med ett maximalt absorptionsband vid 729 nm.Ökning av mängden vatten ledde till en gradvis rödförskjutning av malmabsorptionsmaximum till 800 nm, vilket indikerar J-aggregation av malm i det sammansatta systemet.Fotoluminescensspektra för RuDA i olika lösningsmedel visas i tilläggsfigur 6. RuDA verkar uppvisa typisk NIR-II-luminescens med en maximal emissionsvåglängd på ca.1050 nm i CH2Cl2 respektive CH3OH.Den stora Stokes-förskjutningen (ca 300 nm) av RuDA indikerar en signifikant förändring i geometrin för det exciterade tillståndet och bildandet av lågenergiexciterade tillstånd.Luminescenskvantutbytena av malm i CH2Cl2 och CH3OH bestämdes till 3,3 respektive 0,6%.I en blandning av metanol och vatten (5/95, v/v) observerades dock en liten rödförskjutning av emissionen och en minskning av kvantutbytet (0,22%), vilket kan bero på självmontering av malm. .
För att visualisera självmonteringen av ORE använde vi flytande atomkraftsmikroskopi (AFM) för att visualisera de morfologiska förändringarna i ORE i metanollösning efter att ha tillsatt vatten.När vattenhalten var under 80 % observerades ingen tydlig aggregation (kompletterande fig. 7).Men med en ytterligare ökning av vattenhalten till 90–95 % uppstod små nanopartiklar, vilket tydde på självmontering av malm.Dessutom påverkade laserbestrålning med en våglängd på 808 nm inte absorptionsintensiteten av RuDA i vatten lösning (fig. 2C och tilläggsfig. 8).Däremot sjönk absorbansen av indocyaningrönt (ICG som kontroll) snabbt vid 779 nm, vilket indikerar utmärkt fotostabilitet för RuDA.Dessutom undersöktes stabiliteten av RuDA-NPs i PBS (pH = 5,4, 7,4 och 9,0), 10% FBS och DMEM (högt glukos) genom UV-synlig absorptionsspektroskopi vid olika tidpunkter.Som visas i tilläggsfigur 9 observerades små förändringar i RuDA-NP-absorptionsband i PBS vid pH 7,4/9,0, FBS och DMEM, vilket indikerar utmärkt stabilitet hos RuDA-NP.I ett surt medium (рН = 5,4) hittades dock hydrolys av malm.Vi utvärderade också stabiliteten hos RuDA och RuDA-NP med hjälp av högpresterande vätskekromatografi (HPLC) metoder.Som visas i tilläggsfigur 10 var RuDA stabil i en blandning av metanol och vatten (50/50, v/v) under den första timmen, och hydrolys observerades efter 4 timmar.Emellertid observerades endast en bred konkav-konvex topp för RuDA NPs.Därför användes gelpermeationskromatografi (GPC) för att bedöma stabiliteten hos RuDA NPs i PBS (pH = 7,4).Som visas i tilläggsfigur 11, efter 8 timmars inkubation under de testade förhållandena, ändrades inte topphöjden, toppbredden och topparean för NP RuDA signifikant, vilket indikerar utmärkt stabilitet för NP RuDA.Dessutom visade TEM-bilder att morfologin för RuDA-NP-nanopartiklarna förblev praktiskt taget oförändrad efter 24 timmar i utspädd PBS-buffert (pH = 7,4, tilläggsbild 12).
Eftersom självmontering kan ge malm olika funktionella och kemiska egenskaper, observerade vi frisättningen av 9,10-antracendiylbis(metylen)dimalonsyra (ABDA, indikator 1O2) i metanol-vattenblandningar.Malm med olika vattenhalt50.Som visas i figur 2D och tilläggsfigur 13 observerades ingen nedbrytning av ABDA när vattenhalten var under 20 %.Med en ökning av luftfuktigheten till 40 % inträffade ABDA-nedbrytning, vilket framgår av en minskning av intensiteten av ABDA-fluorescens.Det har också observerats att högre vattenhalt resulterar i snabbare nedbrytning, vilket tyder på att RuDA självmontering är nödvändig och fördelaktig för ABDA-nedbrytning.Detta fenomen skiljer sig mycket från moderna ACQ (aggregation-induced quenching) kromoforer.När det bestrålas med en laser med en våglängd på 808 nm är kvantutbytet av 1O2 RuDA i en blandning av 98% H2O/2% DMF 16,4%, vilket är 82 gånger högre än det för ICG (ΦΔ = 0,2%)51, uppvisar en anmärkningsvärd genereringseffektivitet 1O2 RuDA i tillståndet av aggregering.
Elektronspin med användning av 2,2,6,6-tetrametyl-4-piperidinon (TEMP) och 5,5-dimetyl-1-pyrrolin-N-oxid (DMPO) som spinnfällor Resonansspektroskopi (ESR) användes för att identifiera de resulterande arterna AFK.av RuDA.Som visas i tilläggsfigur 14 har det bekräftats att 1O2 genereras vid bestrålningstider mellan 0 och 4 minuter.Dessutom, när RuDA inkuberades med DMPO under bestrålning, detekterades en typisk fyra-linjers EPR-signal av 1:2:2:1 DMPO-OH·addukt, vilket indikerar bildningen av hydroxylradikaler (OH·).Sammantaget visar ovanstående resultat förmågan hos RuDA att stimulera ROS-produktion genom en dubbel typ I/II fotosensibiliseringsprocess.
För att bättre förstå de elektroniska egenskaperna hos RuDA i monomera och aggregerade former, beräknades gränsmolekylära orbitaler av RuDA i monomera och dimera former med hjälp av DFT-metoden.Såsom visas i fig.3A delokaliseras den högsta ockuperade molekylära orbitalen (HOMO) av monomert RuDA längs ligandryggraden och den lägsta lediga molekylära orbitalen (LUMO) är centrerad på TDP-acceptorenheten.Tvärtom är elektrontätheten i den dimera HOMO koncentrerad till liganden för en RuDA-molekyl, medan elektrondensiteten i LUMO huvudsakligen är koncentrerad till acceptorenheten hos en annan RuDA-molekyl, vilket indikerar att RuDA finns i dimeren.Funktioner hos CT.
A HOMO och LUMO för malm beräknas i monomera och dimera former.B Singlet- och triplettenerginivåer av malm i monomerer och dimerer.C Uppskattade nivåer av RuDA och möjliga ISC-kanaler som monomera C och dimera D. Pilar indikerar möjliga ISC-kanaler.
Fördelningen av elektroner och hål i lågenergi-singlet-exciterade tillstånd av RuDA i monomera och dimera former analyserades med hjälp av Multiwfn 3.852.53-mjukvaran, som beräknades med TD-DFT-metoden.Som anges på tilläggsetiketten.Som visas i figurerna 1-2 är monomera RDA-hål mestadels delokaliserade längs ligandryggraden i dessa singlettexciterade tillstånd, medan elektroner mestadels är lokaliserade i TDP-gruppen, vilket visar de intramolekylära egenskaperna hos CT.Dessutom, för dessa singlett-exciterade tillstånd, finns det mer eller mindre överlappning mellan hål och elektroner, vilket tyder på att dessa singlet-exciterade tillstånd ger ett visst bidrag från lokal excitation (LE).För dimerer observerades, förutom intramolekylära CT- och LE-egenskaper, en viss andel intermolekylära CT-egenskaper i respektive tillstånd, särskilt S3, S4, S7 och S8, baserat på intermolekylär CT-analys, med CT intermolekylära övergångar som de viktigaste (Kompletterande tabell).3).
För att bättre förstå de experimentella resultaten undersökte vi ytterligare egenskaperna hos RuDA-exciterade tillstånd för att utforska skillnaderna mellan monomerer och dimerer (kompletterande tabeller 4–5).Som visas i figur 3B är energinivåerna för de singlett- och triplettexciterade tillstånden för dimeren mycket tätare än monomerens, vilket hjälper till att minska energigapet mellan S1 och Tn. Det har rapporterats att ISC-övergångarna skulle kunna realiseras inom små energigap (ΔES1-Tn < 0,3 eV) mellan S1 och Tn54. Det har rapporterats att ISC-övergångarna skulle kunna realiseras inom ett litet energigap (ΔES1-Tn < 0,3 eV) mellan S1 och Tn54. Сообщалось, что переходы ISC могут быть реализованы в пределах небольшой энергетической щели щели (ΔES1-жn ДES1-жn. Det har rapporterats att ISC-övergångar kan realiseras inom ett litet energigap (ΔES1-Tn <0,3 eV) mellan S1 och Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0.3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0.3 eV）内实现。 Сообщалось, что переход ISC может быть реализован в пределах небольшой энергетической щели (ΔДES1,3Tn. ДЕ0, 3 n. 1, 1, 3, 1, 1, 2, 2, 3 Det har rapporterats att ISC-övergången kan realiseras inom ett litet energigap (ΔES1-Tn < 0,3 eV) mellan S1 och Tn54.Dessutom måste endast en orbital, upptagen eller obesatt, skilja sig åt i bundna singlett- och tripletttillstånd för att ge en SOC-integral som inte är noll.Sålunda, baserat på analysen av excitationsenergin och orbitalövergången, visas alla möjliga kanaler för ISC-övergången i Fig.3C,D.Noterbart är att endast en ISC-kanal är tillgänglig i monomeren, medan den dimera formen har fyra ISC-kanaler som kan förbättra ISC-övergången.Därför är det rimligt att anta att ju fler RuDA-molekyler som aggregeras, desto mer tillgängliga blir ISC-kanalerna.Därför kan RuDA-aggregat bilda tvåbands elektroniska strukturer i singlett- och tripletttillstånden, vilket minskar energigapet mellan S1 och tillgänglig Tn, vilket ökar effektiviteten hos ISC för att underlätta generering av 1O2.
För att ytterligare belysa den underliggande mekanismen syntetiserade vi en referensförening av arene-Ru(II)-komplexet (RuET) genom att ersätta två etylgrupper med två trifenylaminfenylgrupper i RuDA (Fig. 4A, för fullständig karakterisering, se ESI, Tillägg 15 -21 ) Från donator (dietylamin) till acceptor (TDF), RuET har samma intramolekylära CT-egenskaper som RuDA.Som förväntat visade absorptionsspektrumet för RuET i DMF ett band med låg energiladdningsöverföring med stark absorption i det nära infraröda området i området 600–1100 nm (Fig. 4B).Dessutom observerades RuET-aggregation också med ökande vattenhalt, vilket återspeglades i rödförskjutningen av absorptionsmaximum, vilket ytterligare bekräftades av flytande AFM-avbildning (kompletterande fig. 22).Resultaten visar att RuET, liksom RuDA, kan bilda intramolekylära tillstånd och självmontera till aggregerade strukturer.
Kemisk struktur av RuET.B Absorptionsspektra för RuET i blandningar av olika förhållanden av DMF och vatten.Tomter C EIS Nyquist för RuDA och RuET.Fotoströmsvar D av RuDA och RuET under inverkan av laserstrålning med en våglängd på 808 nm.
Fotonedbrytningen av ABDA i närvaro av RuET utvärderades genom bestrålning med en laser med en våglängd på 808 nm.Överraskande nog observerades ingen nedbrytning av ABDA i olika vattenfraktioner (tilläggsbild 23).En möjlig orsak är att RuET inte effektivt kan bilda en bandad elektronisk struktur eftersom etylkedjan inte främjar effektiv intermolekylär laddningsöverföring.Därför utfördes elektrokemisk impedansspektroskopi (EIS) och transienta fotoströmmätningar för att jämföra de fotoelektrokemiska egenskaperna hos RuDA och RuET.Enligt Nyquist-diagrammet (Figur 4C) visar RuDA en mycket mindre radie än RuET, vilket innebär att RuDA56 har snabbare intermolekylär elektrontransport och bättre konduktivitet.Dessutom är fotoströmdensiteten för RuDA mycket högre än den för RuET (Fig. 4D), vilket bekräftar den bättre laddningsöverföringseffektiviteten hos RuDA57.Således spelar fenylgruppen av trifenylamin i malm en viktig roll för att tillhandahålla intermolekylär laddningsöverföring och bildning av en bandad elektronisk struktur.
För att öka tumörackumulering och in vivo biokompatibilitet, kapslade vi ytterligare RuDA med F127.Den genomsnittliga hydrodynamiska diametern för RuDA-NPs bestämdes till 123,1 nm med en smal fördelning (PDI = 0,089) med användning av den dynamiska ljusspridningsmetoden (DLS) (Figur 5A), som främjade tumörackumulering genom att öka permeabiliteten och retentionen.EPR) effekt.TEM-bilderna visade att Ore NPs har en enhetlig sfärisk form med en genomsnittlig diameter på 86 nm.Speciellt uppträdde absorptionsmaximum för RuDA-NPs vid 800 nm (kompletterande Fig. 24), vilket indikerar att RuDA-NPs kan behålla funktionerna och egenskaperna hos självmonterande RuDA.Det beräknade ROS-kvantutbytet för NP Malm är 15,9 %, vilket är jämförbart med Malm. De fototermiska egenskaperna hos RuDA NPs studerades under inverkan av laserstrålning med en våglängd på 808 nm med hjälp av en infraröd kamera.Såsom visas i fig.5B,C upplevde kontrollgruppen (endast PBS) en liten temperaturökning, medan temperaturen på RuDA-NPs-lösningen ökade snabbt med ökande temperatur (AT) till 15,5, 26,1 och 43,0°C.Höga koncentrationer var 25, 50 respektive 100 µM, vilket indikerar en stark fototermisk effekt av RuDA NP.Dessutom togs uppvärmnings-/kylningscykelmätningar för att utvärdera den fototermiska stabiliteten hos RuDA-NP och jämföra med ICG.Temperaturen på malm-NPs minskade inte efter fem uppvärmnings-/kylningscykler (fig. 5D), vilket indikerar den utmärkta fototermiska stabiliteten hos malm-NP:er.I motsats härtill uppvisar ICG lägre fototermisk stabilitet sett från det uppenbara försvinnandet av den fototermiska temperaturplatån under samma förhållanden.Enligt den tidigare metoden58 beräknades den fototermiska omvandlingseffektiviteten (PCE) för RuDA-NP till 24,2 %, vilket är högre än befintliga fototermiska material som guld nanorods (21,0%) och guld nanoskal (13,0%)59.Således uppvisar NP Malm utmärkta fototermiska egenskaper, vilket gör dem till lovande PTT-medel.
Analys av DLS- och TEM-bilder av RuDA NP (infälld).B Värmebilder av olika koncentrationer av RuDA NP exponerade för laserstrålning vid en våglängd på 808 nm (0,5 W cm-2).C Fototermiska omvandlingskurvor för olika koncentrationer av malm-NP, vilka är kvantitativa data.B. D Temperaturökning av ORE NP och ICG under 5 värme- och kylcykler.
Fotocytotoxicitet av RuDA NP mot MDA-MB-231 humana bröstcancerceller utvärderades in vitro.Såsom visas i fig.6A, B, RuDA-NPs och RuDA uppvisade försumbar cytotoxicitet i frånvaro av bestrålning, vilket antyder lägre mörktoxicitet för RuDA-NPs och RuDA.Efter exponering för laserstrålning vid en våglängd på 808 nm visade emellertid RuDA och RuDA NP stark fotocytotoxicitet mot MDA-MB-231 cancerceller med IC50-värden (halva maximala hämmande koncentrationen) på 5,4 respektive 9,4 μM, vilket visar att RuDA-NP och RuDA har potential för fototerapi av cancer.Dessutom undersöktes fotocytotoxiciteten av RuDA-NP och RuDA ytterligare i närvaro av vitamin C (Vc), en ROS-rensare, för att klargöra rollen av ROS i ljusinducerad cytotoxicitet.Uppenbarligen ökade cellviabiliteten efter tillsats av Vc, och IC50-värdena för RuDA och RuDA NPs var 25,7 respektive 40,0 μM, vilket bevisar den viktiga rollen för ROS i fotocytotoxiciteten hos RuDA och RuDA NP.Ljusinducerad cytotoxicitet av RuDA-NPs och RuDA i MDA-MB-231 cancerceller genom färgning av levande/döda celler med användning av kalcein AM (grön fluorescens för levande celler) och propidiumjodid (PI, röd fluorescens för döda celler).bekräftas av celler) som fluorescerande prober.Som visas i figur 6C förblev celler behandlade med RuDA-NP eller RuDA livsdugliga utan bestrålning, vilket framgår av intensiv grön fluorescens.Tvärtom, under laserbestrålning observerades endast röd fluorescens, vilket bekräftar den effektiva fotocytotoxiciteten hos RuDA eller RuDA NP.Det är anmärkningsvärt att grön fluorescens uppträdde vid tillsats av Vc, vilket indikerar ett brott mot fotocytotoxiciteten hos RuDA och RuDA NP.Dessa resultat överensstämmer med fotocytotoxicitetsanalyser in vitro.
Dosberoende livsduglighet för A RuDA- och B RuDA-NP-celler i MDA-MB-231-celler i närvaro eller frånvaro av Vc (0,5 mM), respektive.Felstaplar, medelvärde ± standardavvikelse (n = 3). Oparade, tvåsidiga t-test *p < 0,05, **p < 0,01 och ***p < 0,001. Oparade, tvåsidiga t-test *p < 0,05, **p < 0,01 och ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 och ***p <0,001. Oparade tvåsidiga t-test *p<0,05, **p<0,01 och ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 och ***p <0,001. Oparade tvåsidiga t-test *p<0,05, **p<0,01 och ***p<0,001.C Färgningsanalys av levande/döda celler med användning av kalcein AM och propidiumjodid som fluorescerande prober.Skalstång: 30 µm.Representativa bilder av tre biologiska upprepningar från varje grupp visas.D Konfokala fluorescensbilder av ROS-produktion i MDA-MB-231-celler under olika behandlingsförhållanden.Grön DCF-fluorescens indikerar närvaron av ROS.Bestråla med en laser med en våglängd på 808 nm med en effekt på 0,5 W/cm2 i 10 minuter (300 J/cm2).Skalstång: 30 µm.Representativa bilder av tre biologiska upprepningar från varje grupp visas.E Flödescytometri RuDA-NPs (50 µM) eller RuDA (50 µM) behandlingsanalys med eller utan 808 nm laser (0,5 W cm-2) i närvaro och frånvaro av Vc (0,5 mM) under 10 min.Representativa bilder av tre biologiska upprepningar från varje grupp visas.F Nrf-2, HSP70 och HO-1 av MDA-MB-231-celler behandlade med RuDA-NPs (50 µM) med eller utan 808 nm laserbestrålning (0,5 W cm-2, 10 min, 300 J cm-2), celler uttrycker 2).Representativa bilder av två biologiska upprepningar från varje grupp visas.
Intracellulär ROS-produktion i MDA-MB-231-celler undersöktes med användning av 2,7-diklordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA) färgningsmetoden.Såsom visas i fig.6D uppvisade celler behandlade med RuDA-NPs eller RuDA distinkt grön fluorescens när de bestrålades med 808 nm-lasern, vilket indikerar att RuDA-NPs och RuDA har en effektiv förmåga att generera ROS.Tvärtom, i frånvaro av ljus eller i närvaro av Vc, observerades endast en svag fluorescerande signal från cellerna, vilket indikerade en liten bildning av ROS.Intracellulära ROS-nivåer i RuDA-NP-celler och RuDA-behandlade MDA-MB-231-celler bestämdes ytterligare genom flödescytometri.Som visas i tilläggsfigur 25 ökades den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) genererad av RuDA-NPs och RuDA under 808 nm laserbestrålning signifikant med cirka 5,1 respektive 4,8 gånger jämfört med kontrollgruppen, vilket bekräftar deras utmärkta bildning av AFK.kapacitet.Emellertid var intracellulära ROS-nivåer i RuDA-NP- eller MDA-MB-231-celler behandlade med RuDA endast jämförbara med kontroller utan laserbestrålning eller i närvaro av Vc, liknande resultaten av konfokal fluorescensanalys.
Det har visats att mitokondrier är huvudmålet för Ru(II)-arenkomplex60.Därför undersöktes den subcellulära lokaliseringen av RuDA och RuDA-NPs.Som visas i tilläggsfigur 26 visar RuDA och RuDA-NP liknande cellulära distributionsprofiler med den högsta ackumuleringen i mitokondrier (62,5 ± 4,3 respektive 60,4 ± 3,6 ng/mg protein).Emellertid hittades endast en liten mängd Ru i kärnfraktionerna av Malm och NP Malm (3,5 respektive 2,1 %).Den återstående cellfraktionen innehöll resterande rutenium: 31,7 % (30,6 ± 3,4 ng/mg protein) för RuDA och 42,9 % (47,2 ± 4,5 ng/mg protein) för RuDA-NPs.I allmänhet ackumuleras malm och NP malm huvudsakligen i mitokondrier.För att bedöma mitokondriell dysfunktion använde vi JC-1 och MitoSOX Red-färgning för att bedöma mitokondriell membranpotential respektive superoxidproduktionskapacitet.Som visas i tilläggsbild 27 observerades intensiv grön (JC-1) och röd (MitoSOX Röd) fluorescens i celler behandlade med både RuDA och RuDA-NPs under 808 nm laserbestrålning, vilket tyder på att både RuDA och RuDA-NPs högfluorescerande Det kan effektivt inducera mitokondriell membrandepolarisering och superoxidproduktion.Dessutom bestämdes mekanismen för celldöd med hjälp av flödescytometribaserad analys av annexin V-FITC/propidiumjodid (PI).Som visas i figur 6E, när de bestrålades med 808 nm laser, inducerade RuDA och RuDA-NP en signifikant ökad tidig apoptoshastighet (nedre högra kvadranten) i MDA-MB-231-celler jämfört med PBS eller PBS plus laser.bearbetade celler.Men när Vc tillsattes, minskade apoptoshastigheten för RuDA och RuDA-NP signifikant från 50,9% och 52,0% till 15,8% respektive 17,8%, vilket bekräftar den viktiga rollen för ROS i fotocytotoxiciteten av RuDA och RuDA-NP..Dessutom observerades lätta nekrotiska celler i alla testade grupper (övre vänstra kvadranten), vilket tyder på att apoptos kan vara den dominerande formen av celldöd inducerad av RuDA och RuDA-NPs.
Eftersom oxidativ stressskada är en viktig bestämningsfaktor för apoptos, undersöktes den nukleära faktorn associerad med erytroid 2, faktor 2 (Nrf2) 62, en nyckelregulator för antioxidantsystemet, i RuDA-NPs-behandlad MDA-MB-231.Verkningsmekanism för RuDA NPs inducerad av bestrålning.Samtidigt detekterades också uttryck av nedströmsproteinet hem oxygenas 1 (HO-1).Som visas i figur 6F och kompletterande figur 29 ökade RuDA-NP-medierad fototerapi nivåerna av Nrf2 och HO-1 uttryck jämfört med PBS-gruppen, vilket indikerar att RuDA-NPs kan stimulera signalvägar för oxidativ stress.Dessutom, för att studera den fototermiska effekten av RuDA-NPs63, utvärderades uttrycket av värmechockproteinet Hsp70 också.Det är tydligt att celler behandlade med RuDA-NPs + 808 nm laserbestrålning visade ökat uttryck av Hsp70 jämfört med de andra två grupperna, vilket återspeglar ett cellulärt svar på hypertermi.
De anmärkningsvärda resultaten in vitro fick oss att undersöka prestandan in vivo av RuDA-NP i nakna möss med MDA-MB-231-tumörer.Vävnadsfördelningen av RuDA NPs studerades genom att bestämma innehållet av rutenium i levern, hjärtat, mjälten, njurarna, lungorna och tumörerna.Såsom visas i fig.7A visade det maximala innehållet av malm-NPs i normala organ vid den första observationstiden (4 timmar), medan det maximala innehållet bestämdes i tumörvävnader 8 timmar efter injektion, möjligen på grund av malm-NPs.EPR-effekt av LF.Enligt distributionsresultaten togs den optimala behandlingstiden med NP-malm 8 timmar efter administrering.För att illustrera processen för ackumulering av RuDA-NPs i tumörställen övervakades de fotoakustiska (PA) egenskaperna hos RuDA-NPs genom att registrera PA-signalerna för RuDA-NPs vid olika tidpunkter efter injektion.Först utvärderades PA-signalen för RuDA-NP in vivo genom att registrera PA-bilder av ett tumörställe efter intratumoral injektion av RuDA-NP.Som visas i tilläggsfigur 30 visade RuDA-NP en stark PA-signal och det fanns en positiv korrelation mellan RuDA-NP-koncentration och PA-signalintensitet (kompletterande figur 30A).Sedan in vivo PA-bilder av tumörställen registrerades efter intravenös injektion av RuDA och RuDA-NP vid olika tidpunkter efter injektion.Som visas i figur 7B ökade PA-signalen för RuDA-NPs från tumörstället gradvis med tiden och nådde en platå 8 timmar efter injektionen, i överensstämmelse med vävnadsfördelningsresultat bestämda med ICP-MS-analys.Med avseende på RuDA (kompletterande fig. 30B) uppträdde den maximala PA-signalintensiteten 4 timmar efter injektion, vilket indikerar en snabb hastighet för inträde av RuDA i tumören.Dessutom undersöktes utsöndringsbeteendet hos RuDA och RuDA-NP genom att bestämma mängden rutenium i urin och avföring med hjälp av ICP-MS.Den huvudsakliga elimineringsvägen för RuDA (Supplerande Fig. 31) och RuDA-NPs (Fig. 7C) är via feces, och effektiv clearance av RuDA och RuDA-NPs observerades under den 8-dagars studieperioden, vilket innebär att RuDA och RuDA-NPs kan effektivt elimineras från kroppen utan långvarig toxicitet.
A. Ex vivo-distribution av RuDA-NP i musvävnader bestämdes av Ru-innehållet (procentandel av administrerad dos av Ru (ID) per gram vävnad) vid olika tidpunkter efter injektion.Data är medelvärde ± standardavvikelse (n = 3). Oparade, tvåsidiga t-test *p < 0,05, **p < 0,01 och ***p < 0,001. Oparade, tvåsidiga t-test *p < 0,05, **p < 0,01 och ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 och ***p <0,001. Oparade tvåsidiga t-test *p<0,05, **p<0,01 och ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 och ***p <0,001. Oparade tvåsidiga t-test *p<0,05, **p<0,01 och ***p<0,001.B PA-bilder av tumörställen in vivo vid 808 nm excitation efter intravenös administrering av RuDA-NPs (10 µmol kg-1) vid olika tidpunkter.Efter intravenös administrering av RuDA NPs (10 µmol kg-1) utsöndrades C Ru från möss med urin och feces vid olika tidsintervall.Data är medelvärde ± standardavvikelse (n = 3).
Uppvärmningskapaciteten för RuDA-NP in vivo studerades i nakna möss med MDA-MB-231 och RuDA-tumörer för jämförelse.Såsom visas i fig.8A och kompletterande Fig. 32 visade kontrollgruppen (saltlösning) mindre temperaturförändring (AT ≈ 3°C) efter 10 minuters kontinuerlig exponering.Emellertid ökade temperaturen på RuDA-NPs och RuDA snabbt med maximala temperaturer på 55,2 respektive 49,9 °C, vilket ger tillräcklig hypertermi för cancerterapi in vivo.Den observerade ökningen av hög temperatur för RuDA NPs (ΔT ≈ 24°C) jämfört med RuDA (ΔT ≈ 19°C) kan bero på dess bättre permeabilitet och ackumulering i tumörvävnader på grund av EPR-effekten.
Infraröda värmebilder av möss med MDA-MB-231-tumörer bestrålade med 808 nm laser vid olika tidpunkter 8 timmar efter injektion.Representativa bilder av fyra biologiska upprepningar från varje grupp visas.B Relativ tumörvolym och C Genomsnittlig tumörmassa för olika grupper av möss under behandling.D Kurvor av kroppsvikter för olika grupper av möss.Bestråla med en laser med en våglängd på 808 nm med en effekt på 0,5 W/cm2 i 10 minuter (300 J/cm2).Felstaplar, medelvärde ± standardavvikelse (n = 3). Oparade, tvåsidiga t-test *p < 0,05, **p < 0,01 och ***p < 0,001. Oparade, tvåsidiga t-test *p < 0,05, **p < 0,01 och ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 och ***p <0,001. Oparade tvåsidiga t-test *p<0,05, **p<0,01 och ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 och ***p <0,001. Oparade tvåsidiga t-test *p<0,05, **p<0,01 och ***p<0,001. E H&E-färgningsbilder av större organ och tumörer från olika behandlingsgrupper, inklusive saltlösning, koksaltlösning + laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs och RuDA-NPs + Lasergrupper. E H&E-färgningsbilder av större organ och tumörer från olika behandlingsgrupper, inklusive saltlösning, koksaltlösning + laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs och RuDA-NPs + Lasergrupper. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. E H&E-färgningsbilder av större organ och tumörer från olika behandlingsgrupper, inklusive saltlösning, saltlösning + laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs och RuDA-NPs + Lasergrupper.来自 不同 治疗 组 的 主要 器官 和 肿瘤 的 E H & e 染色 图像 ， 包括 盐水 、 盐 水 + 激光 、 Ruda 、 Ruda + 激光 、 Ruda-nps 和 Ruda-nps + 激光组 激光组。来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Окрашивание E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая физиологический раствор, физиологический раствор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. E H&E-färgning av större organ och tumörer från olika behandlingsgrupper inklusive saltlösning, saltlösning + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs och RuDA-NPs + laser.Skalstång: 60 µm.
Effekten av fototerapi in vivo med RuDA och RuDA NPs utvärderades där nakna möss med MDA-MB-231 tumörer intravenöst injicerades med RuDA eller RuDA NPs i en enkel dos på 10,0 µmol kg-1 via svansvenen, och sedan 8 timmar efter injektionen.laserstrålning med en våglängd på 808 nm.Som visas i figur 8B ökade tumörvolymerna signifikant i saltlösnings- och lasergrupperna, vilket indikerar att saltlösning eller laser 808-bestrålning hade liten effekt på tumörtillväxt.Liksom i saltlösningsgruppen observerades även snabb tumörtillväxt hos möss behandlade med RuDA-NPs eller RuDA i frånvaro av laserbestrålning, vilket visar deras låga mörkertoxicitet.Däremot, efter laserbestrålning, inducerade både RuDA-NP- och RuDA-behandling signifikant tumörregression med tumörvolymminskningar på 95,2% respektive 84,3% jämfört med den saltlösningsbehandlade gruppen, vilket indikerar utmärkt synergistisk PDT., medierad av RuDA/CHTV-effekten.– NP eller malm Jämfört med RuDA visade RuDA NP en bättre fototerapeutisk effekt, vilket främst berodde på EPR-effekten av RuDA NP.Tumörtillväxthämningsresultat bedömdes ytterligare genom att tumörvikten avlägsnades på dag 15 av behandlingen (fig. 8C och kompletterande fig. 33).Medeltumörmassan i RuDA-NP-behandlade möss och RuDA-behandlade möss var 0,08 respektive 0,27 g, vilket var mycket lättare än i kontrollgruppen (1,43 g).
Dessutom registrerades kroppsvikten hos möss var tredje dag för att studera den mörka toxiciteten av RuDA-NPs eller RuDA in vivo.Såsom visas i figur 8D observerades inga signifikanta skillnader i kroppsvikt för alla behandlingsgrupper. Vidare utfördes hematoxylin- och eosin- (H&E)-färgning av huvudorganen (hjärta, lever, mjälte, lunga och njure) från olika behandlingsgrupper. Dessutom utfördes hematoxylin- och eosin- (H&E)-färgning av huvudorganen (hjärta, lever, mjälte, lunga och njure) från olika behandlingsgrupper. Кроме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, печени, печени, печени, печени, печи Dessutom utfördes hematoxylin och eosin (H&E) färgning av större organ (hjärta, lever, mjälte, lungor och njurar) från olika behandlingsgrupper.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）辺和肾脏）进眨缌脏 (HAN) Кроме того, проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селечени, селечном Dessutom utfördes hematoxylin och eosin (H&E) färgning av större organ (hjärta, lever, mjälte, lunga och njure) i olika behandlingsgrupper.Som visas i fig.8E, H&E-färgningsbilderna av fem större organ från RuDA-NPs och RuDA-grupperna uppvisar inga uppenbara abnormiteter eller organskador. 8E, H&E-färgningsbilderna av fem större organ från RuDA-NPs och RuDA-grupperna uppvisar inga uppenbara abnormiteter eller organskador.Såsom visas i fig.8E, изображения окрашивания H&E ansluter основных органов из групп RuDA-NPs och RuDA nе демонстрируют явных аноилигов. 8E, H&E-färgningsbilder av fem större organ från RuDA-NPs och RuDA-grupperna visar inga uppenbara organavvikelser eller lesioner.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显的像没有显的夺帺如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Hur är det för рисунке 8E? Som visas i figur 8E visade H&E-färgningsbilder av de fem huvudorganen från RuDA-NPs och RuDA-grupperna inga uppenbara abnormiteter eller organskador.Dessa resultat visade att varken RuDA-NP eller RuDA visade tecken på toxicitet in vivo. Dessutom visade H&E-färgningsbilder av tumörer att både RuDA + Laser och RuDA-NPs + Laser-grupperna kunde orsaka allvarlig cancercellsförstörelse, vilket visar den utmärkta in vivo fototerapeutiska effekten av RuDA och RuDA-NPs. Dessutom visade H&E-färgningsbilder av tumörer att både RuDA + Laser och RuDA-NPs + Laser-grupperna kunde orsaka allvarlig cancercellsförstörelse, vilket visar den utmärkta in vivo fototerapeutiska effekten av RuDA och RuDA-NPs.Dessutom visade hematoxylin-eosin-färgade tumörbilder att både RuDA+Laser- och RuDA-NPs+Laser-grupper kan inducera allvarlig förstörelse av cancerceller, vilket visar den överlägsna fototerapeutiska effekten av RuDA och RuDA-NPs in vivo.此外，肿瘤的H&E 染色图像显示，RuDA + Laser 和RuDA-NPs + Laser 组均可导致严重的癌细胞破坏，证明了RuDA 和RuDA-NPs 的优异的体内光疗功效。此外 ， 肿瘤 的 & e 染色 显示 ， RUDA + LASER 和 RUDA-NPS + LASER 组均 导致 的 癌 细胞 破坏 ， 证明 了 RUDA 和 RUDA-NPS 的 的 体内 光疗 光疗 的 癌 癌 细胞 破坏 ， ， 了 了 和 和 和 和 和 和 和 和 和 的 的 体内 体内 体内 体内 体内 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 体内 体内 体内 体内 体内 体内. . . .Dessutom visade hematoxylin- och eosinfärgade tumörbilder att både RuDA+Laser- och RuDA-NPs+Laser-grupper resulterade i allvarlig förstörelse av cancerceller, vilket visar överlägsen fototerapeutisk effekt av RuDA och RuDA-NPs in vivo.
Sammanfattningsvis designades det organometalliska Ru(II)-aren (RuDA)-komplexet med DA-typ ligander för att underlätta ISC-processen med användning av aggregeringsmetoden.Syntetiserat RuDA kan självmontera genom icke-kovalenta interaktioner för att bilda RuDA-härledda supramolekylära system, och därigenom underlätta 1O2-bildning och effektiv fototermisk omvandling för ljusinducerad cancerterapi.Det är anmärkningsvärt att monomert RuDA inte genererade 1O2 under laserbestrålning vid 808 nm, men kunde generera en stor mängd 1O2 i det aggregerade tillståndet, vilket visar rationaliteten och effektiviteten i vår design.Efterföljande studier har visat att den supramolekylära sammansättningen ger RuDA förbättrade fotofysiska och fotokemiska egenskaper, såsom rödförskjutningsabsorption och fotoblekningsbeständighet, som är mycket önskvärda för PDT- och PTT-bearbetning.Både in vitro och in vivo experiment har visat att RuDA NPs med god biokompatibilitet och god ackumulering i tumören uppvisar utmärkt ljusinducerad anticanceraktivitet vid laserbestrålning vid en våglängd av 808 nm.Således kommer RuDA NPs som effektiva bimodala supramolekylära PDT/PTW-reagenser att berika uppsättningen av fotosensibilisatorer aktiverade vid våglängder över 800 nm.Den konceptuella designen av det supramolekylära systemet ger en effektiv väg för NIR-aktiverade fotosensibilisatorer med utmärkta fotosensibiliserande effekter.
Alla kemikalier och lösningsmedel erhölls från kommersiella leverantörer och användes utan ytterligare rening.RuCl3 köptes från Boren Precious Metals Co., Ltd. (Kunming, Kina).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolin-5,6-dion) och 4,7-bis[4-(N,N-difenylamino)fenyl]-5 ,6-Diamino-2,1,3-bensotiadiazol syntetiserades enligt tidigare studier64,65.NMR-spektra registrerades på en Bruker Avance III-HD 600 MHz spektrometer vid Southeastern University Analytical Test Center med användning av d6-DMSO eller CDCl3 som lösningsmedel.Kemiska skift δ anges i ppm.med avseende på tetrametylsilan, och interaktionskonstanterna J ges i absoluta värden i hertz.Högupplösande masspektrometri (HRMS) utfördes på ett Agilent 6224 ESI/TOF MS-instrument.Elementaranalys av C, H och N utfördes på en Vario MICROCHNOS elementaranalysator (Elementar).UV-synliga spektra mättes på en Shimadzu UV3600 spektrofotometer.Fluorescensspektra registrerades på en Shimadzu RF-6000 spektrofluorimeter.EPR-spektra registrerades på ett Bruker EMXmicro-6/1-instrument.Morfologin och strukturen hos de preparerade proverna studerades på FEI Tecnai G20 (TEM) och Bruker Icon (AFM) instrument som arbetar vid en spänning på 200 kV.Dynamisk ljusspridning (DLS) utfördes på en Nanobrook Omni-analysator (Brookhaven).Fotoelektrokemiska egenskaper mättes på en elektrokemisk uppställning (CHI-660, Kina).Fotoakustiska bilder erhölls med FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR-systemet.Konfokala bilder erhölls med ett Olympus FV3000 konfokalmikroskop.FACS-analys utfördes på en BD Calibur flödescytometer.Högpresterande vätskekromatografi (HPLC)-experiment utfördes på ett Waters Alliance e2695-system med användning av en 2489 UV/Vis-detektor.Gelpermeationskromatografi (GPC)-tester registrerades på ett Thermo ULTIMATE 3000-instrument med användning av en ERC RefratoMax520 brytningsindexdetektor.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolin-5,6-dion)64 (481,0 mg, 1,0 mmol), 4,7-bis[4-(N, N-difenylamino)fenyl]-5,6-diamino-2,1,3-bensotiadiazol 65 (652,0 mg, 1,0 mmol) och isättika (30 ml) omrördes vid återloppskokning i kylskåp i 12 timmar.Lösningsmedlet avlägsnades sedan i vakuum med användning av en rotationsindunstare.Den resulterande återstoden renades genom snabbkolonnkromatografi (silikagel, CH2Cl2:MeOH=20:1) för att erhålla RuDA som ett grönt pulver (utbyte: 877,5 mg, 80%).anus.Beräknat för C64H48Cl2N8RuS: C 67,84, H 4,27, N 9,89.Funnet: C 67,92, H 4,26, N 9,82.'H NMR (600 MHz, d6-DMSO) 5 10,04 (s, 2H), 8,98 (s, 2H), 8,15 (s, 2H), 7,79 (s, 4H), 7,44 (s, 8H), 7,21 (d, J = 31,2 Hz, 16H), 6,47 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 2,69 (s, IH), 2,25 (s, 3H), 0,99 (s, 6H).13c nmr (150 MHZ, D6-DMSO), δ (PPM) 158.03, 152.81, 149.31, 147.98, 147.16, 139.98, 136.21, 135.57, 134.68, 130.34, 130.02, 128.68, 128.01, 125.51, 124.45, 120.81, 103.49, 103.49 , 103. , 86.52, 84.75, 63.29, 30.90, 22.29, 18.83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097,25.
Syntes av 4,7-bis[4-(N,N-dietylamino)fenyl-5,6-diamino-2,1,3-bensotiadiazol (L2): L2 syntetiserades i två steg.Pd(PPh3)4 (46 mg, 0,040 mmol) sattes till N,N-dietyl-4-(tributylstannyl)anilin (1,05 g, 2,4 mmol) och 4,7-dibrom-5,6-dinitrolösning - 2, 1,3-bensotiadiazol (0,38 g, 1,0 mmol) i torr toluen (100 ml).Blandningen omrördes vid 100°C under 24 timmar.Efter avlägsnande av toluenen i vakuum tvättades den resulterande fasta substansen med petroleumeter.Därefter omrördes en blandning av denna förening (234,0 mg, 0,45 mmol) och järnpulver (0,30 g, 5,4 mmol) i ättiksyra (20 ml) vid 80°C under 4 timmar.Reaktionsblandningen hälldes i vatten och den resulterande bruna fasta substansen uppsamlades genom filtrering.Produkten renades två gånger genom vakuumsublimering för att ge en grön fast substans (126,2 mg, 57 % utbyte).anus.Beräknat för C26H32N6S: C 67,79, H 7,00, N 18,24.Funnet: C 67,84, H 6,95, H 18,16.'H NMR (600 MHz, CDCI3), 5 (ppm) 7,42 (d, 4H), 6,84 (d, 4H), 4,09 (s, 4H), 3,42 (d, 8H), 1,22 (s, 12H).13° NMR (150 MHz, CDCI3), 5 (ppm) 151,77, 147,39, 138,07, 131,20, 121,09, 113,84, 111,90, 44,34, 12,77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461,24.
Föreningar framställdes och renades enligt procedurer liknande RuDA.anus.Beräknat för C48H48Cl2N8RuS: C 61,27, H 5,14, N 11,91.Funnet: C, 61,32, H, 5,12, N, 11,81, IH NMR (600 MHz, d6-DMSO), 5 (ppm) 10,19 (s, 2H), 9,28 (s, 2H), 8,09 (s, 2H), 7,95 (s, 4H), 6,93 (s, 4H), 6,48 (d, 2H), 6,34 (s, 2H), 3,54 (t, 8H), 2,80 (m, IH), 2,33 (s, 3H), 1,31 (t, 12H), 1,07 (s, 6H).13C NMR (151 MHz, CDCL3), 5 (ppm) 158,20, 153,36, 148,82, 148,14, 138,59, 136,79, 135,75, 134,71, 130,44, 128,87, 128,35, 121,70, 111,8,84, 130,76, 105,05,0,7,0,0,0,8,8. 8.2., 38.06, 31.22, 29.69, 22.29, 19.19, 14.98, 12.93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905,24.
RuDA löstes i MeOH/H2O (5/95, v/v) i en koncentration av 10 μM.Absorptionsspektrumet för RuDA mättes var 5:e minut på en Shimadzu UV-3600 spektrofotometer under bestrålning med laserljus med en våglängd på 808 nm (0,5 W/cm2).ICG-spektra registrerades under samma förhållanden som standarden.
EPR-spektra registrerades på en Bruker EMXmicro-6/1-spektrometer med en mikrovågseffekt på 20 mW, ett skanningsområde på 100 G och en fältmodulering på 1 G. 2,2,6,6-tetrametyl-4-piperidon (TEMP) och 5,5-dimetyl-1-pyrrolin-N-oxid (DMPO) användes som spinnfällor.Elektronspinresonansspektra registrerades för blandade lösningar av RuDA (50 µM) och TEMF (20 mM) eller DMPO (20 mM) under inverkan av laserstrålning med en våglängd på 808 nm (0,5 W/cm2).
DFT- och TD-DFT-beräkningar för RuDA utfördes vid PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ-nivåer i vattenlösning med det Gaussiska programmet 1666,67,68.HOMO-LUMO-, hål- och elektronfördelningarna för det exciterade tillståndet RuDA med lågenergisinglet plottades med hjälp av GaussView-programmet (version 5.0).
Vi försökte först mäta genereringseffektiviteten för 1O2 RuDA med konventionell UV-synlig spektroskopi med ICG (ΦΔ = 0,002) som standard, men fotonedbrytningen av ICG påverkade resultaten starkt.Således mättes kvantutbytet av 1O2 RuDA genom att detektera en förändring i intensiteten av ABDA-fluorescens vid cirka 428 nm när den bestrålades med en laser med en våglängd på 808 nm (0,5 W/cm2).Experiment utfördes på RuDA och RuDA NPs (20 μM) i vatten/DMF (98/2, v/v) innehållande ABDA (50 μM).Kvantutbytet av 1O2 beräknades med hjälp av följande formel: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS och rICG är reaktionshastigheterna för ABDA med 1O2 erhållen från fotosensibilisatorn respektive ICG.APS och AICG är absorbansen för fotosensibilisatorn respektive ICG vid 808 nm.
AFM-mätningar utfördes i flytande förhållanden med användning av skanningsläget på ett Bruker Dimension Icon AFM-system.Med användning av en öppen struktur med flytande celler tvättades cellerna två gånger med etanol och torkades med en ström av kväve.Sätt in de torkade cellerna i mikroskopets optiska huvud.Placera omedelbart en droppe av provet i vätskepoolen och placera den på konsolen med hjälp av en steril engångsplastspruta och en steril nål.Ytterligare en droppe placeras direkt på provet, och när det optiska huvudet sänks smälter de två dropparna samman och bildar en menisk mellan provet och vätskebehållaren.AFM-mätningar utfördes med en SCANASYST-FLUID V-formad nitridkonsol (Bruker, hårdhet k = 0,7 N m-1, f0 = 120–180 kHz).
HPLC-kromatogram erhölls på ett Waters e2695-system utrustat med en phoenix C18-kolonn (250 x 4,6 mm, 5 µm) med användning av en 2489 UV/Vis-detektor.Detektorns våglängd är 650 nm.De mobila faserna A och B var vatten respektive metanol, och den mobila fasens flödeshastighet var 1,0 ml·min-1.Gradienten (lösningsmedel B) var som följer: 100 % från 0 till 4 minuter, 100 % till 50 % från 5 till 30 minuter och återställning till 100 % från 31 till 40 minuter.Malm löstes i en blandad lösning av metanol och vatten (50/50, i volym) i en koncentration av 50 μM.Injektionsvolymen var 20 μl.
GPC-analyser registrerades på ett Thermo ULTIMATE 3000-instrument utrustat med två PL aquagel-OH MIXED-H-kolonner (2×300×7,5 mm, 8 µm) och en ERC RefratoMax520 brytningsindexdetektor.GPC-kolonnen eluerades med vatten vid en flödeshastighet av 1 ml/min vid 30°C.Malm-NP: er löstes i PBS-lösning (pH = 7,4, 50 μM), injektionsvolymen var 20 μL.
Fotoströmmar mättes på en elektrokemisk uppställning (CHI-660B, Kina).De optoelektroniska svaren när lasern slogs på och av (808 nm, 0,5 W/cm2) mättes vid en spänning på 0,5 V i en svart låda.En standardcell med tre elektroder användes med en L-formad glasartad kolelektrod (GCE) som arbetselektrod, en standardkalomelelektrod (SCE) som referenselektrod och en platinaskiva som motelektrod.En 0,1 M Na2S04-lösning användes som en elektrolyt.
Den humana bröstcancercellinjen MDA-MB-231 köptes från KeyGEN Biotec Co., LTD (Nanjing, Kina, katalognummer: KG033).Celler odlades i monolager i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, högt glukos) kompletterat med en lösning av 10% fetalt bovint serum (FBS), penicillin (100 μg/ml) och streptomycin (100 μg/ml).Alla celler odlades vid 37°C i en fuktig atmosfär innehållande 5% CO2.
MTT-analysen användes för att bestämma cytotoxiciteten av RuDA och RuDA-NPs i närvaro och frånvaro av ljusbestrålning, med eller utan Vc (0,5 mM).MDA-MB-231-cancerceller odlades i 96-brunnars plattor vid en celldensitet av cirka 1 x 105 celler/ml/brunn och inkuberades under 12 timmar vid 37,0°C i en atmosfär av 5 % CO2 och 95 % luft.RuDA och RuDA NP lösta i vatten sattes till cellerna.Efter 12 timmars inkubation exponerades cellerna för 0,5 W cm-2 laserstrålning vid en våglängd av 808 nm under 10 minuter (300 J cm-2) och inkuberades sedan i mörker under 24 timmar.Cellerna inkuberades sedan med MTT (5 mg/ml) under ytterligare 5 timmar.Ändra slutligen mediet till DMSO (200 µl) för att lösa upp de resulterande lila formazankristallerna.OD-värden mättes med en mikroplattläsare med en våglängd på 570/630 nm.IC50-värdet för varje prov beräknades med hjälp av SPSS-mjukvaran från dos-responskurvor erhållna från minst tre oberoende experiment.
MDA-MB-231-celler behandlades med RuDA och RuDA-NP i en koncentration av 50 μM.Efter 12 timmars inkubation bestrålades cellerna med en laser med en våglängd på 808 nm och en effekt på 0,5 W/cm2 under 10 min (300 J/cm2).I vitamin C (Vc)-gruppen behandlades celler med 0,5 mM Vc före laserbestrålning.Cellerna inkuberades sedan i mörker i ytterligare 24 timmar, färgades sedan med kalcein AM och propidiumjodid (20 μg/ml, 5 μl) i 30 minuter, tvättades sedan med PBS (10 μl, pH 7,4).bilder av färgade celler.