Nyheter

Tack för att du besöker Nature.com.Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd.För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer).Under tiden, för att säkerställa fortsatt support, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Enzymatiska närhetsmärkningsmetoder baserade på aktiverade estrar eller fenoxiradikaler används i stor utsträckning för att kartlägga subcellulära proteomer och proteininteraktörer i levande celler.Aktiverade estrar är dock mindre reaktiva, vilket resulterar i en bred märkningsradie, och fenoxiradikaler som genereras av peroxidbehandling kan störa redoxvägar.Här rapporterar vi en närhetsmärkningsberoende fotoaktiveringsmetod (PDPL) utvecklad genom att genetiskt koppla miniSOG fotosensibilisatorproteinet till ett protein av intresse.Utlöst av blått ljus och kontrollerat av exponeringstid genereras singlettsyre och sedan uppnås spatiotemporalt upplöst märkning av histidinrester av anilinsonden.Vi visar dess högtrohet genom organellspecifik proteomkartläggning.En jämförelse av PDPL sida vid sida med TurboID visar en mer specifik och omfattande proteomisk täckning av PDPL.Därefter applicerade vi PDPL på den sjukdomsassocierade transkriptionskoaktivatorn BRD4 och E3 Parkinligas och hittade tidigare okända interaktörer.Genom överexpressionsscreening identifierades två okända substrat, Ssu72 och SNW1, för Parkin, vars nedbrytning medieras av ubiquitination-proteasom-vägen.
Exakt karakterisering av proteinnätverk ligger bakom många grundläggande cellulära processer.Därför kommer mycket noggrann spatiotemporal kartläggning av proteininteraktioner att ge en molekylär grund för att dechiffrera biologiska vägar, sjukdomspatologi och störa dessa interaktioner för terapeutiska ändamål.För detta ändamål är metoder som kan detektera tidsmässiga interaktioner i levande celler eller vävnader mycket önskvärda.Affinitetsrening masspektrometri (AP-MS) har historiskt använts för att identifiera bindningspartners för proteiner av intresse (POI).Med utvecklingen av kvantitativa proteomikmetoder skapades Bioplex3.0, den största databasen av proteinnätverk baserade på AP-MS.Även om AP-MS är mycket kraftfullt, är celllysen och utspädningsstegen i arbetsflödet snedställda mot svaga och övergående bindningsinteraktioner och introducerar artefakter efter lys som falska interaktionspar som saknar uppdelning före lysering.
För att komma till rätta med dessa problem har onaturliga aminosyror (UAA) med tvärbindande grupper och plattformar för enzymatisk närliggande märkning (PL) (t.ex. APEX och BioID)5 utvecklats.Även om UAA-metoden har tillämpats framgångsrikt i många scenarier och ger information om direkta proteinlim, krävs fortfarande optimering av UAA-insättningsstället.Ännu viktigare är det en stökiometrisk märkningsmetod som saknar en katalytisk omkastning av märkningshändelser.Enzymatiska PL-metoder, såsom BioID-metoden, förenar däremot det konstruerade biotinligaset till POI7, som därefter aktiverar biotin för att bilda en reaktiv biotinyl-AMP-estermellanprodukt.Enzymet katalyserar och frigör således ett aktiverat biotin-"moln" som märker proximala lysinrester.BioID kräver dock mer än 12 timmar för att erhålla en tillräcklig märkt signal, vilket utesluter dess användning med tidsmässig upplösning.Med hjälp av riktad evolution baserad på jästvisning, designades TurboID baserat på BioID för att vara effektivare, vilket möjliggör effektiv märkning med biotin inom 10 minuter, vilket gör att mer dynamiska processer kan studeras.Eftersom TurboID är mycket aktivt och endogena biotinnivåer är tillräckliga för lågnivåmärkning, blir bakgrundsmärkning ett potentiellt problem när mycket förbättrad och tidsinställd märkning krävs genom tillsats av exogent biotin.Dessutom är aktiverade estrar dåligt reaktiva (t1/2 ~5 min), vilket kan leda till en stor märkningsradie, särskilt efter mättnad av närliggande proteiner med biotin 5. I ett annat tillvägagångssätt, genetisk fusion av konstruerat askorbatperoxidas (dvs biotin- fenolradikaler och tillåter proteinmärkning inom en minut9, 10. APEX används i stor utsträckning för att identifiera subcellulära proteomer, membranproteinkomplex och cytosoliska signalproteinkomplex 11, 12. Behovet av höga koncentrationer av peroxider kan dock påverka redoxproteiner eller vägar, vilket stör cellulära processer.
Således kommer en ny metod som kan generera mer reaktiva undertryckande arter med märkt radie med hög rumslig och tidsmässig noggrannhet utan att avsevärt störa cellulära vägar vara ett viktigt tillägg till befintliga metoder. Bland de reaktiva arterna väckte singlettsyre vår uppmärksamhet på grund av dess korta livslängd och begränsade diffusionsradie (t1/2 < 0,6 µs i celler)13. Bland de reaktiva arterna väckte singlettsyre vår uppmärksamhet på grund av dess korta livslängd och begränsade diffusionsradie (t1/2 < 0,6 µs i celler)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Bland de aktiva formerna väckte singlettsyre vår uppmärksamhet på grund av dess korta livslängd och begränsade diffusionsradie (t1/2 < 0,6 µs i celler)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs 伕跳ﺬ伕〷 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Bland aktiva former drar singlettsyre till sig vår uppmärksamhet på grund av dess korta livslängd och begränsade diffusionsradie (t1/2 < 0,6 μs i celler).Singletsyre har rapporterats slumpmässigt oxidera metionin, tyrosin, histidin och tryptofan, vilket gör det polärt 14,15 för vidhäftning till amin- eller tiolbaserade prober16,17.Även om singlettsyre har använts för att märka subcellulärt fack-RNA, förblir strategier för att återanvända endogena POI-närhetsmarkörer outforskade.Här presenterar vi en plattform som heter photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL), där vi använder blått ljus för att belysa POI:er sammansmälta med en miniSOG fotosensibilisator och utlösa singletsyregenerering för att oxidera proximala rester, följt av amininnehållande modifieringar för att oxidera kemiska sonder till mellanliggande levande celler..Vi testade en grupp kemiska sonder för att maximera taggspecificiteten och identifierade modifieringsplatser med ett öppet proteomik-arbetsflöde.En jämförelse av PDPL sida vid sida med TurboID visar en mer specifik och omfattande proteomisk täckning av PDPL.Vi tillämpade detta tillvägagångssätt på organellspecifika markörer för det subcellulära proteomet och allmän proteomidentifiering av bindningspartners för det cancerassocierade epigenetiska regulatoriska proteinet BRD4 och Parkinsons sjukdomsassocierade E3-ligas Parkin, vilket bekräftade både ett känt och ett okänt nätverk av protein interaktioner..Förmågan hos PDPL att känna igen E3-substrat i stora proteinkomplex representerar en situation där igenkänning av indirekta bindemedel krävs.Två okända parkinsubstrat förmedlade av ubiquitination-proteasom har bekräftats in situ.
Fotodynamisk terapi (PDT)19 och kromoforassisterad laserinaktivering (CALI)20, där ljusbestrålning med fotosensibilisatorer genererar singlettsyre, kan inaktivera målproteiner eller orsaka celldöd.Eftersom singlettsyre är en mycket reaktiv substans med ett teoretiskt diffusionsavstånd på cirka 70 nm, kan rumsligt begränsad oxidation runt fotosensibilisatorn kontrolleras.Baserat på detta koncept bestämde vi oss för att använda singletsyre för att uppnå nära märkning av proteinkomplex i levande celler.Vi har utvecklat ett PDPL kemoproteomiskt tillvägagångssätt för att uppfylla fyra funktioner: (1) att katalysera genereringen av aktivt singlettsyre liknande det enzymatiska PL-metoden;(2) tillhandahålla tidsupplöst märkning vid ljusinitiering;(3) genom förändring (4) Undvik att använda endogena kofaktorer (som biotin) för att minska bakgrunden, eller använd mycket störande exogena reagens (som peroxider) för att minimera cellexponering för miljöstress.
Fotosensibilisatorer kan delas in i två kategorier inklusive fluoroforer med liten molekylvikt (t.ex. rosa bengal, metylenblått)22 och genetiskt kodade små proteiner (t.ex. miniSOG, KillerRed)23.För att uppnå en modulär design utvecklade vi den första generationens PDPL-plattform genom att lägga till fotosensibiliserande (PS) proteiner till POI24,25 (Figur 1a).När det bestrålas med blått ljus, oxiderar singlettsyre proximala nukleofila aminosyrarester, vilket resulterar i en umpolung polaritet som är elektrofil och kan reagera ytterligare med aminsondsnukleofiler16,17.Sonden är designad med ett alkynhandtag för att tillåta klickkemi och neddragning för LC/MS/MS-karakterisering.
Schematisk illustration av märkning av proteinkomplex medierade av miniSOG.När de utsätts för blått ljus genererar celler som uttrycker miniSOG-POI singletsyre, som modifierar interagerande proteiner men inte icke-bindande proteiner.Mellanprodukter av fotooxidation fångas upp av reläetiketter för den aminkemiska sonden för att bilda kovalenta addukter.Alkynylgruppen på kemiproben tillåter klickkemi för anrikning genom neddragning följt av LC-MS/MS-kvantifiering.b Kemisk struktur för aminsonder 1-4.c Representativ fluorescerande gelanalys av mitokondriella lokaliserade miniSOG-medierade proteomiska markörer med hjälp av sonder 1-4 och relativ kvantifiering baserad på geldensitometri.Signal-till-bakgrundsförhållandet för kemiska sonder utvärderades med användning av negativa kontrollexperiment exklusive blått ljus eller med användning av HEK293T-celler utan miniSOG-uttryck.n = 2 biologiskt oberoende prover.Varje prick representerar en biologisk kopia.d Representativ detektion och kvantifiering av PDPL med användning av optimerad sond 3 i närvaro eller frånvaro av de angivna PDPL-komponenterna som c.n = 3 biologiskt oberoende prover.Varje prick representerar en biologisk kopia.Mittlinjer och morrhår representerar medelvärdet och ± standardavvikelsen.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Konfokal avbildning av singletsyre med långt röd Si-DMA-färgning.Skalstång: 10 µm.Gelavbildning och konfokala experiment upprepades oberoende minst två gånger med liknande resultat.
Vi testade först förmågan hos de mogna fotosensibilisatorerna miniSOG26 och KillerRed23, stabilt uttryckta i HEK293T, att förmedla propargylaminmärkning av proteomet som en kemisk sond (kompletterande Fig. 1a).Gelfluorescensanalys visade att märkning av hela proteomer uppnåddes med miniSOG och bestrålning med blått ljus, medan ingen synlig märkningsprodukt observerades med KillerRed.För att förbättra signal-till-bakgrundsförhållandet testade vi sedan en uppsättning kemiska sonder som innehöll anilin (1 och 3), propylamin (2) eller bensylamin (4).Vi observerade att HEK293T-celler själva hade en högre bakgrundssignal jämfört med inget blått ljus, möjligen på grund av den endogena fotosensibilisatorn för riboflavin, flavinmononukleotid (FMN) 27 . Anilinbaserade kemiska prober 1 och 3 gav bättre specificitet, med HEK293T som stabilt uttrycker miniSOG i mitokondrier som visar en >8-faldig ökning av signalen för sond 3, medan sond 2 som användes i RNA-märkningsmetoden CAP-seq endast visade ~2,5- signalökning, troligen på grund av olika reaktivitetspreferenser mellan RNA och protein (Fig. 1b, c). Anilinbaserade kemiska prober 1 och 3 gav bättre specificitet, med HEK293T som stabilt uttrycker miniSOG i mitokondrier som visar en >8-faldig ökning av signalen för sond 3, medan sond 2 som användes i RNA-märkningsmetoden CAP-seq endast visade ~2,5- signalökning, troligen på grund av olika reaktivitetspreferenser mellan RNA och protein (Fig. 1b, c).Anilinbaserade kemiska prober 1 och 3 visade bättre specificitet: HEK293T, som stabilt uttrycker miniSOG i mitokondrier, visar mer än en 8-faldig ökning av signalen för sond 3, medan sond 2, som används i CAP-seq RNA-märkningsmetoden, endast visar ~2,5-faldig signalökning, troligen på grund av olika reaktivitetspreferenser mellan RNA och protein (Fig. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 ， HEK293T 在 线 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 增加> 8 倍 ， 而 于 于 RNA 标记 方法 方法 表达 表达 的 探针 探针 仅 仅 仅 仅 仅 仅 仅 仅 仅 仅 仅 仅 仅 仅 仅 仅 仅 仅 仅 仅 增加 倍 倍 倍 而 于 于 于 标记 方法 方法 方法 方法 方法 方法 的 的 的 的 的 的 探针 探针 探针 探针 仅 仅 仅 仅 仅 仅 仅 仅 仅 仅 仅 增加> 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 ， ， HEK293T 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 RNA 标记 Cap-EQ 的 2 仅 ~ ~ ~ 2,5 -倍信号增加，可能是由于RNAAnilinbaserade kemiska prober 1 och 3 hade bättre specificitet, HEK293T uttryckte stabilt miniSOG i mitokondrier, och sond 3 hade en över 8-faldig ökning av signalen, medan sond 2 för CAP-seq RNA-märkningsmetoden endast visade ~2,5-faldig ökning.i signalen, troligen på grund av olika reaktionspreferenser mellan RNA och protein (Fig. 1b, c).Dessutom testades sond 3-isomerer och hydrazinsonder (sonder 5, 6, 7), vilket bekräftade optimeringen av sond 3 (kompletterande fig. Ib, c).På liknande sätt avslöjade fluorescensanalys i gel andra optimerade experimentella parametrar: bestrålningsvåglängd (460 nm), kemisk sondkoncentration (1 mM) och bestrålningstid (20 min) (kompletterande fig. 2a–c).Att utelämna någon komponent eller steg i PDPL-protokollet resulterade i betydande signalomkastning till bakgrunden (Fig. Id).Speciellt reducerades proteinmärkningen signifikant i närvaro av natriumazid eller trolox, som är kända för att släcka singlettsyre.Närvaron av D2O, som är känt för att stabilisera singletsyre, förstärker märkningssignalen.För att undersöka bidraget från andra reaktiva syrearter till märkning, tillsattes mannitol och vitamin C för att etablera hydroxyl- respektive superoxidradikaler, 18, 29, men de visade sig inte minska märkningen.Tillsats av H2O2, men inte belysning, resulterade inte i märkning (tilläggsbild 3a).Fluorescens-singlettsyreavbildning med Si-DMA-sonder bekräftade närvaron av singlettsyre i HEK293T-miniSOG-tråden, men inte i den ursprungliga HEK293T-tråden.Dessutom kunde mitoSOX Red inte detektera superoxidproduktion efter belysning (fig. 1e och kompletterande fig. 3b) 30. Dessa data tyder starkt på att singlettsyre är den huvudsakliga reaktiva syrearten som ansvarar för efterföljande proteommärkning.Cytotoxicitet av PDPL utvärderades inklusive bestrålning med blått ljus och kemiska sönder, och ingen signifikant cytotoxicitet observerades (kompletterande fig. 4a).
För att studera märkningsmekanismen och möjliggöra proteomisk identifiering av proteinkomplex med hjälp av LC-MS/MS, måste vi först bestämma vilka aminosyror som är modifierade och deltamassan av sondmärkningar.Metionin, histidin, tryptofan och tyrosin har rapporterats modifieras av singlettsyre14,15.Vi integrerar TOP-ABPP31-arbetsflödet med den opartiska öppna sökningen från FragPipe-datorplattformen baserad på MSFragger32.Efter singletsyremodifiering och kemisk sondmärkning utfördes klickkemi med användning av en biotinreduktionsmärkning innehållande en klyvbar linker, följt av neutravidin-sträckning och trypsin-digestion.Den modifierade peptiden, fortfarande bunden till hartset, fotoklyvdes för LC-MS/MS-analys (Figur 2a och kompletterande data 1).Ett stort antal modifieringar inträffade i hela proteomet med över 50 peptidkarta (PSM)-matchningar listade (Fig. 2b).Överraskande nog observerade vi bara modifiering av histidin, förmodligen på grund av den högre reaktiviteten hos oxiderat histidin mot anilinsonder än andra aminosyror.Enligt den publicerade mekanismen för histidinoxidation med singlettsyre,21,33 motsvarar den föreslagna delta-massastrukturen på +229 Da addukten av sond 3 med 2-oxo-histidin efter två oxidationer, medan +247 Da är hydrolysprodukten av +229 Da (kompletterande fig. 5).Utvärderingen av MS2-spektrumet visade en hög tillförlitlighet för identifiering av de flesta y- och b-jonerna, inklusive identifieringen av modifierade fragmentjoner (y och b) (Fig. 2c).Kontextanalys av den lokala sekvensen av PDPL-modifierade histidiner avslöjade en måttlig motivpreferens för små hydrofoba rester vid ±1 positioner (kompletterande fig. 4b).I genomsnitt identifierades 1,4 histidiner per protein, och ställena för dessa markörer bestämdes genom lösningsmedelstillgänglig ytarea (SASA) och relativ lösningsmedelstillgänglighet (RSA) analys (kompletterande fig. 4c,d).
Ett opartiskt arbetsflöde för att studera kvarvarande selektivitet med hjälp av FragPipe-datorplattformen som drivs av MSFragger.Klyvbara linkers används i Click-kemi för att tillåta fotoklyvning av modifierade peptider från streptavidinharts.En öppen sökning lanserades för att identifiera många modifieringar, såväl som relevanta rester.b Tilldela massan av modifieringar som förekommer i hela proteomet.Peptidkartläggning PSM.c MS2 spektral annotering av histidinställen modifierade med prob 3. Som ett representativt exempel tillsatte en kovalent reaktion med prob 3 +229,0938 Da till den modifierade aminosyran.d Mutationsanalys används för att testa för PDPL-markörer.PRDX3 (H155A, H225A) och PRDX1 (H10A, H81A, H169A) transfekterades med vildtypsplasmider för anti-Flag-detektion.e Den syntetiska peptiden reagerades med renad miniSOG i närvaro av sond 3 och motsvarande produkter med Am +247 och +229 noterades i LC-MS-spektrumet.f In vitro protein-till-protein-interaktioner modellerade med miniSOG-6xHis-tag och anti-6xHis antikropp.Antibiotin (streptavidin-HRP) och anti-mus Western blot-analys av miniSOG-6xHis/anti-6xHis antikroppskomplex märkta med sond 3, beroende på tidpunkten för exponering för ljus.Märkningar för individuella proteiner uttrycks i motsvarande molekylvikt: LC-antikropp lätt kedja, HC antikropp tung kedja.Dessa experiment upprepades oberoende minst två gånger med liknande resultat.
För biokemisk verifiering av märkningsstället ändrades PRDX3 och PRDX1 identifierade med masspektrometri från histidin till alanin och jämfördes med vildtyp i transfektionsanalyser.PDPL-resultaten visade att mutationen signifikant reducerade märkningen (Fig. 2d).Under tiden syntetiserades peptidsekvenserna som identifierades i den öppna sökningen och reagerade in vitro med renad miniSOG i närvaro av sond 3 och blått ljus, vilket gav produkter med en massförskjutning på +247 och +229 Da när de detekterades med LC-MS (Fig. 2e).).För att testa om interagerande proximala proteiner kunde märkas in vitro som svar på miniSOG-fotoaktivering, designade vi en artificiell närhetsanalys genom interaktion mellan miniSOG-6xHis-proteinet och en anti-His monoklonal antikropp in vitro (Figur 2f).I denna analys förväntade vi oss proximal märkning av antikroppars tunga och lätta kedjor med miniSOG.Faktum är att anti-mus (som känner igen de tunga och lätta kedjorna av anti-6xHis-märkt antikropp) och streptavidin Western blöts visade stark biotinylering av de tunga och lätta kedjorna.Särskilt noterade vi miniSOG-autobiotinylering på grund av 6xHis-taggen och tvärbindningar mellan lätta och tunga kedjor, vilket kan vara relaterat till det tidigare beskrivna gapet mellan lysin och 2-oxo-histidin proximalt svar.Sammanfattningsvis drar vi slutsatsen att PDPL modifierar histidin på ett närhetsberoende sätt.
Vårt nästa mål var att karakterisera det subcellulära proteomet för att testa specificiteten för in situ-märkning.Därför uttryckte vi stabilt miniSOG i kärnan, mitokondriell matris eller yttre ER-membranet hos HEK293T-celler (Fig. 3a).Gelfluorescensanalys avslöjade rikligt med märkta band vid tre subcellulära platser såväl som olika märkningsmönster (Fig. 3b).Fluorescensavbildningsanalys visade hög specificitet för PDPL (Fig. 3c).PDPL-arbetsflödet följdes av klickreaktioner med rhodaminfärgämnen för att avgränsa subcellulära proteomer med hjälp av fluorescensmikroskopi, och PDPL-signaler samlokaliserades med DAPI, mitokondriella spårare eller ER-spårare, vilket bekräftar PDPLs högtrohet.För de tre organellplatserna visade en jämförelse sida vid sida av PDPL med TurboID med avidin western blot att PDPL märktes mer specifikt jämfört med deras respektive kontroller.Under PDPL-förhållanden uppträdde fler märkta band, vilket indikerar fler PDPL-märkta proteiner (kompletterande fig. 6a-d).
en schematisk representation av miniSOG-medierad organellspecifik proteommärkning.miniSOG riktar sig mot mitokondriella matrisen via fusion till de N-terminala 23 aminosyrorna av human COX4 (mito-miniSOG), kärnan via fusion till H2B (nucleus-miniSOG) och Sec61β via den cytoplasmatiska sidan av ER-membranet (ER-miniSOG) ).Indikationer inkluderar gelavbildning, konfokal avbildning och masspektrometri.b Representativa gelbilder av tre organellspecifika PDPL-profiler.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Representativa konfokala bilder av HEK293T-celler som stabilt uttrycker miniSOG med olika subcellulära lokaliseringar detekterade av antikropp märkt V5 (röd).Subcellulära markörer används för mitokondrier och ER (grön).PDPL-arbetsflödet inkluderar detektering av miniSOG (gul) märkta subcellulära proteomer med hjälp av Cy3-azid-klickkemi.Skalstång: 10 µm.d Vulkaniska plots av PDPL-märkta proteomer i olika organeller kvantifierade genom omärkt kvantifiering (n = 3 oberoende biologiska experiment).Two-tailed Student's t-test användes på vulkanplaner.HEK293T vildtyp användes som en negativ kontroll. Signifikant förändrade proteiner markeras i rött (p < 0,05 och >2-faldig skillnad i jonintensitet). Signifikant förändrade proteiner markeras i rött (p < 0,05 och >2-faldig skillnad i jonintensitet). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 och >2-кратная разница в интенсивности ионов). Signifikant förändrade proteiner är markerade i rött (p < 0,05 och >2-faldig skillnad i jonintensitet).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 och > 2-кратная разница в ионной силе). Signifikant förändrade proteiner är markerade i rött (p < 0,05 och > 2-faldig skillnad i jonstyrka).Relaterade proteiner som är viktiga för HEK293T-miniSOG men inte viktiga för HEK293T visas i grönt.e Analys av specificiteten hos proteomiska datamängder från experiment d.Det totala antalet statistiskt signifikanta proteiner i varje organell (röda och gröna prickar) är markerat överst.Histogram visar proteiner lokaliserade i organeller baserat på MitoCarta 3.0, GO-analys och A. Ting et al.människor.Separata datamängder för mitokondrier, kärnor och ER.Dessa experiment upprepades oberoende minst två gånger med liknande resultat.Rådata tillhandahålls i form av rådatafiler.
Uppmuntrad av gel- och avbildningsresultaten användes etikettfri kvantifiering för att kvantifiera det identifierade proteomet i varje organell (kompletterande data 2).Otransfekterad HEK293T användes som en negativ kontroll för att subtrahera bakgrundsmarkörer. Vulkanplotanalys visade signifikant berikade proteiner (p < 0,05 och > 2-faldig jonintensitet) såväl som singletonproteiner som endast finns i miniSOG-uttryckande linjer (Fig. 3d röda och gröna prickar). Vulkanplotanalys visade signifikant berikade proteiner (p < 0,05 och > 2-faldig jonintensitet) såväl som singletonproteiner som endast finns i miniSOG-uttryckande linjer (Fig. 3d röda och gröna prickar). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Vulkanplotanalys visade signifikant berikade proteiner (p<0,05 och >2-faldig jonintensitet) såväl som enstaka proteiner som endast finns i miniSOG-uttryckande linjer (Fig. 3d, röda och gröna prickar).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 以及 仅 存 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3D 红色 和 绿色点）。。。 在于 在于 在于 在于 在于 表达 的 单一 蛋白质 蛋白质 （图 3D 红色 和 绿色点）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Vulkanplotanalys avslöjade signifikant berikade proteiner (p<0,05 och >2x jonstyrka) såväl som enstaka proteiner som endast finns i miniSOG-expressionslinjen (röda och gröna prickar i fig. 3d).Genom att kombinera dessa data identifierade vi 1364, 461 och 911 statistiskt signifikanta nukleära, mitokondriella och ER yttre membranproteiner, respektive.För att analysera noggrannheten hos organelllokaliserad PDPL använde vi MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) analys och A. Ting et al.en datauppsättning8 användes för mitokondrier, kärna och ER för att testa organellspecificiteten för de detekterade proteinerna, motsvarande en noggrannhet på 73,4, 78,5 och 73,0% (Fig. 3e).Specificiteten hos PDPL bekräftar att PDPL är ett idealiskt verktyg för att identifiera organellspecifika proteomer.Noterbart visade submitokondriell analys av identifierade mitokondriella proteiner att det fångade proteomet huvudsakligen var fördelat i matrisen och det inre membranet (226 respektive 106), vilket stod för 91,7% (362) av det totala antalet identifierade mitokondriella proteiner.en hög nivå av PDPL bekräftades dessutom (kompletterande fig. 7a).På liknande sätt visade subnukleär analys att det fångade proteomet huvudsakligen var fördelat i kärnan, nukleoplasman och nukleolen (kompletterande fig. 7b).Nukleär proteomisk analys med en nukleär lokaliseringssignalpeptid (3xNLS) visade liknande noggrannhet som H2B-konstruktionen (kompletterande fig. 7c-h).För att bestämma specificiteten för PDPL-markören valdes nukleärt laminin A som en mer diskret lokaliserad POI7-fälla.PDPL identifierade 36 signifikant berikade proteiner, varav 12 proteiner (30,0 % inklusive lamin A) var välkarakteriserade lamin A-interagerande proteiner annoterade av String-databasen, med en högre procentandel än BioID-metoden (122 proteiner) 28 av 28. , 22,9 %) 7. Vår metod identifierade färre proteiner, möjligen på grund av begränsade märkningsområden, vilket möjliggjordes av mer aktivt singlettsyre.GO-analys visade att de identifierade proteinerna huvudsakligen var lokaliserade i nukleoplasman (26), kärnmembranet (10), kärnmembranet (9) och kärnporerna (5).Tillsammans stod dessa nukleärt lokaliserade proteiner för 80% av de berikade proteinerna, vilket ytterligare visar specificiteten för PDPL (kompletterande fig. 8a–d).
Efter att ha fastställt förmågan hos PDPL att utföra närhetsmärkning i organeller, testade vi sedan om PDPL kunde användas för att analysera POI-bindningspartners.I synnerhet försökte vi definiera PDPL-analys av cytosoliska proteiner, som anses vara svårare mål än deras membranlokaliserade motsvarigheter på grund av deras mycket dynamiska natur.Bromodomain och extraterminal (BET) protein BRD4 har uppmärksammats för sin nyckelroll i olika sjukdomar 35, 36 .Komplexet som bildas av BRD4 är en transkriptionskoaktivator och ett viktigt terapeutiskt mål.Genom att reglera uttrycket av c-myc och Wnt5a transkriptionsfaktorer anses BRD4 vara en nyckeldeterminant för akut myeloid leukemi (AML), multipelt myelom, Burkitts lymfom, tjocktarmscancer och inflammatoriska sjukdomar37,38.Dessutom riktar vissa virus sig mot BRD4 för att reglera viral och cellulär transkription, såsom papillomvirus, HIV och SARS-CoV-236,39.
För att kartlägga BRD4-interaktionen med PDPL kombinerade vi miniSOG med en kort N- eller C-terminal isoform av BRD4.Proteomiska resultat avslöjade en hög grad av överlappning mellan de två konstruktionerna (kompletterande fig. 9a).Det nukleära proteomet identifierat med miniSOG-H2B täcker 77,6 % av proteinerna som interagerar med BRD4 (kompletterande fig. 9b).Sedan användes olika tider för belysning (2, 5, 10, 20 min) för att justera markörradien (Fig. 4a och kompletterande data 3).Vi drar slutsatsen att vid kortare fotoperioder kommer PDPL främst att märka direkta bindningspartners, medan längre perioder kommer att inkludera proteiner identifierade under kortare fotoaktiveringsperioder såväl som indirekta mål i märkningskomplex.Faktum är att vi fann stark överlappning mellan intilliggande tidpunkter (84,6 % under 2 och 5 min; 87,7 % under 5 och 10 min; 98,7 % under 10 och 20 min) (fig. 4b och kompletterande fig. 9c).I alla experimentella grupper hittade vi inte bara BRD4 självmärkning, utan flera kända mål som MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A och HMGB1 kommenterade i strängdatabasen.Jonstyrkan hos dessa mål är proportionell mot exponeringstiden (fig. 4c och tilläggsfig. 9d).GO-analys av proteinerna som identifierades i 2-minutersgruppen visade att de identifierade proteinerna var lokaliserade i kärnan och var involverade i kromatinremodellering och RNA-polymerasfunktion.Proteinets molekylära funktion berikades i kromatinbindning eller transkriptionell samaktivering, i överensstämmelse med BRD4-funktionen (Fig. 4d).Strängdatabasaktiverad proteininteraktionsanalys avslöjade en första nivå av indirekta interaktioner mellan BRD4- och HDAC-familjens interagerande komplex som SIN3A, NCOR2, BCOR och SAP130 (Fig. 4e och Kompletterande Fig. 9e), i överensstämmelse med BRD4- och HDAC-bindande acetylerade histoner ..Dessutom bekräftades representativa mål identifierade av LC-MS/MS, inklusive Sin3A, NSUN2, Fus och SFPQ, genom Western blotting (Fig. 4f).Nyligen har den korta isoformen av BRD4 rapporterats bilda kärnor med vätske-vätskefasseparation (LLPS) egenskaper.De RNA-bindande proteinerna Fus och SFPQ förmedlar LLPS av olika cellulära processer och har här identifierats som oregistrerade BRD4-bindande proteiner.Interaktionen mellan BRD4 och SFPQ bekräftades av co-immunoprecipitation (co-IP) experiment (Figur 4g), vilket tyder på en annan mekanism för BRD4-medierad vätske-vätskefasseparation som förtjänar ytterligare undersökning.Sammantaget tyder dessa resultat på att PDPL är en idealisk plattform för att identifiera kända BRD4-interagerande såväl som okända bindande proteiner.
en schematisk representation av miniSOG-medierad BRD4 närhetsmarkering, exponeringstider: 2, 5, 10 och 20 min.b Överlappning av proteiner identifierade vid olika belysningstider.Proteinberikning identifierad i HEK293T-miniSOG-BRD4 var statistiskt signifikant jämfört med vildtyp HEK293T.c Jonintensitet vid kvantifiering av omärkta representativa kända BRD4-bindande proteiner under den specificerade exponeringstiden.n = 3 biologiskt oberoende prover.Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse.d Genontologisk analys (GO) av proteiner identifierade i 2-minutersgruppen.De tio första GO-termerna är listade.Bubblor är färgade enligt GO-termkategorin och bubbelstorleken är proportionell mot antalet proteiner som finns i varje term.e Stränganalys av proteiner som interagerar med BRD4.De gula cirklarna är direkt lim och de grå cirklarna är det första lagret av indirekt lim.De röda linjerna representerar de experimentellt bestämda interaktionerna och de blå linjerna representerar de förutsagda interaktionerna.f Representativa BRD4-bindande mål identifierade i LC-MS/MS verifierades med Western blotting.g Samimmunoutfällningsexperiment bekräftar interaktionen mellan SFPQ och BRD4.Dessa experiment upprepades oberoende minst två gånger med liknande resultat.Rådata tillhandahålls i form av rådatafiler.
Förutom att identifiera oregistrerade POI-associerade mål, antar vi att PDPL kommer att vara lämplig för att identifiera substrat för enzymer, vilket skulle kräva karakterisering av indirekt bindande proteiner i stora komplex för att kommentera oregistrerade substrat.Parkin (kodas av PARK2) är ett E3-ligas och mutationer i parkin är kända för att orsaka autosomal recessiv juvenil Parkinsons sjukdom (AR-JP)42.Dessutom har parkin beskrivits som väsentligt för mitofagi (mitokondriell autofagi) och avlägsnande av reaktiva syrearter.Men även om flera parkinsubstrat har identifierats är parkins roll i denna sjukdom fortfarande oklar.För att kommentera dess okarakteriserade substrat testades PDPL genom att lägga till miniSOG till N- eller C-terminalen av parkin.Celler behandlades med karbonylcyanidprotontransportören m-klorfenylhydrazon (CCCP) för att aktivera parkin via PINK1-Parkin-vägen.Jämfört med våra BRD4 PDPL-resultat avslöjade parkin N-terminal fusion en större uppsättning målproteiner, även om den täckte en större del av C-terminalen (177 av 210) (Figur 5a, b och kompletterande data 4).resultatet överensstämmer med rapporter om att N-terminala taggar på ett avvikande sätt kan aktivera Parkin44.Överraskande nog fanns det bara 18 överlappande proteiner i våra data med publicerade AP-MS-resultat för Parkin43, troligtvis på grund av skillnader mellan cellinjer och proteomikarbetsflöden.Förutom fyra kända proteiner (ARDM1, HSPA8, PSMD14 och PSMC3) identifierade med två metoder (Fig. 5c)43.För att ytterligare validera resultaten av LC-MS/MS användes PDPL-behandling och efterföljande Western blotting för att jämföra resultaten av HEK293T-föräldercellsanalysen och den stabila N-terminala parkinlinjen.Tidigare okända mål CDK2, DUT, CTBP1 och PSMC4 testades med ett känt bindemedel, DNAJB1 (Fig. 5d).
Vulkanplot av parkin-interagerande proteiner i HEK293T-celler med stabilt uttryckt miniSOG fuserat till N- eller C-terminalen av parkin (n = 3 oberoende biologiska experiment).Two-tailed Student's t-test användes på vulkanplaner.HEK293T användes som en negativ kontroll. Signifikant förändrade proteiner markeras i rött (p < 0,05 och >2-faldig skillnad i jonintensitet). Signifikant förändrade proteiner markeras i rött (p < 0,05 och >2-faldig skillnad i jonintensitet). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 och >2-кратная разница в интенсивности ионов). Signifikant förändrade proteiner är markerade i rött (p < 0,05 och >2-faldig skillnad i jonintensitet).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 och > 2-кратная разница в ионной силе). Signifikant förändrade proteiner är markerade i rött (p < 0,05 och > 2-faldig skillnad i jonstyrka).Relaterade proteiner som är viktiga för HEK293T-miniSOG men inte viktiga för HEK293T visas i grönt.b Venn-diagram som visar överlappande proteiner mellan N-terminala och C-terminala konstruktioner.N-terminala taggar kan avvikande aktivera parkin och resultera i mer igenkännliga proteiner.c Venn-diagram som visar överlappande proteiner mellan PDPL och AP-MS.Kända interaktörer listas, inklusive 4 av 18 överlappande proteiner och 11 av 159 proteiner specifikt identifierade i PDPL.d Representativa mål identifierade av LC-MS/MS verifierades med Western blotting.e Ssu72 och SNW1 identifierades som oregistrerade parkinsubstrat.Dessa FLAG-märkta proteinplasmider transfekterades in i HEK293T och HEK293T-Parkin-miniSOG följt av CCCP-behandling vid olika tidpunkter.Nedbrytningen var mer uttalad i Parkin-överuttryckslinjen.f Genom att använda proteasomhämmaren MG132 bekräftades det att nedbrytningsprocessen av Ssu72 och SNW1 förmedlas av proteasom-ubiquitination.Dessa experiment upprepades oberoende minst två gånger med liknande resultat.Rådata tillhandahålls i form av rådatafiler.
Speciellt måste proteinerna som identifieras av PDPL inkludera parkinbindande proteiner och deras substrat.För att upptäcka oregistrerade parkinsubstrat valde vi ut sju identifierade proteiner (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 och SNW1) och transfekterade plasmider för att exponera dessa gener för normal HEK293T och stabilt uttrycka miniSOG-Parkins behandling följt av HEK293T.Nivåerna av Ssu72- och SNW1-proteiner reducerades signifikant i den stabila miniSOG-Parkin-linjen (Fig. 5e).Behandling med CCCP under 12 timmar resulterade i den mest signifikanta nedbrytningen av båda substraten.För att undersöka om nedbrytningen av Ssu72 och SNW1 regleras av proteasom-ubiquitination, tillsattes proteasominhibitorn MG132 för att hämma proteasomaktivitet, och i själva verket fann vi att deras nedbrytningsprocess hämmades (Fig. 5f).Ytterligare icke-substratmål bekräftades som Parkin-interaktorer med hjälp av Western blotting (kompletterande fig. 10), som visade överensstämmande resultat med LC-MS/MS.Sammanfattningsvis möjliggör integrationen av PDPL-arbetsflödet med målproteintransfektionsverifiering identifiering av oregistrerade E3-ligassubstrat.
Vi har utvecklat en gemensam plattform för närhetsmarkering som låter dig identifiera interagerande POI i rum och tid.Plattformen är baserad på miniSOG fotosensibiliserande protein, som bara är cirka 12 kDa, mindre än hälften av storleken på det mogna APEX2-enzymet (27 kDa) och en tredjedel av storleken på TurboID (35 kDa).Den mindre storleken bör avsevärt utöka utbudet av applikationer för att studera små proteininteraktomer.Ytterligare utforskning av ytterligare fotosensibilisatorer, oavsett om det är genetiskt kodade proteiner eller små molekyler, behövs för att öka kvantutbytet av singlettsyre och utöka känsligheten för detta tillvägagångssätt.För den nuvarande versionen av miniSOG kan hög tidsupplösning uppnås med blå belysning för att aktivera närhetsmarkörer.Dessutom frigjorde längre exponeringstid ett större "moln" av singlettsyre, vilket resulterade i modifiering av mer distala histidinrester, ökad märkningsradie och förmågan att finjustera PDPL-rumsupplösningen.Vi testade också sju kemiska sonder för att öka signal-till-bakgrundsförhållandet och utforskade den molekylära mekanismen bakom detta tillvägagångssätt.TOP-ABPP-arbetsflödet kombinerat med opartisk öppen sökning bekräftade att modifieringar endast inträffade i histidiner och ingen konsekvent mikromiljö observerades för ökade histidinmodifieringar, förutom en måttlig preferens för histidiner i loopregionen.
PDPL har också använts för att karakterisera subcellulära proteomer med proteomspecificitet och täckning åtminstone jämförbar med andra närhetsmärkning och organellspecifika kemiska sondmetoder.Närhetsmarkörer har också framgångsrikt använts för att karakterisera ytan, lysosomala och sekretomassocierade proteomer46,47.Vi tror att PDPL kommer att vara kompatibel med dessa subcellulära organeller.Dessutom utmanade vi PDPL genom att identifiera mål för cytosolisk proteinbindning som är mer komplexa än membranbundna proteiner på grund av deras dynamiska egenskaper och involvering i mer tidsmässiga interaktioner.PDPL applicerades på två proteiner, transkriptionskoaktivatorn BRD4 och det sjukdomsassocierade ligaset E3 Parkin.Dessa två proteiner valdes inte bara för deras grundläggande biologiska funktioner, utan också för deras kliniska relevans och terapeutiska potential.För dessa två POI identifierades välkända bindningspartners såväl som oregistrerade mål.Särskilt det fasseparationsassocierade proteinet SFPQ bekräftades av co-IP, vilket kan indikera en ny mekanism genom vilken BRD4 (kort isoform) reglerar LLPS.Samtidigt tror vi att identifiering av Parkin-substrat är ett scenario där identifiering av indirekta lim krävs.Vi identifierade två oidentifierade parkinsubstrat och bekräftade deras nedbrytning längs ubiquitination-proteasom-vägen.Nyligen har en mekanismbaserad fångststrategi utvecklats för att detektera hydrolassubstrat genom att fånga dem med enzymer.Även om detta är en mycket kraftfull metod är den inte lämplig för analys av substrat involverade i bildandet av stora komplex och kräver bildandet av kovalenta bindningar mellan enzymet och substratet.Vi förväntar oss att PDPL kan utvidgas till att studera andra proteinkomplex och enzymfamiljer, såsom deubiquitinas- och metalloproteasfamiljerna.
En ny form av miniSOG, kallad SOPP3, har utvecklats med förbättrad singletsyreproduktion.Vi jämförde miniSOG med SOPP3 och fann förbättrad markeringsprestanda, även om signal-brusförhållandet förblev oförändrat (tilläggsbild 11).Vi antog att optimering av SOPP3 (t.ex. genom riktad evolution) skulle leda till effektivare fotosensibiliserande proteiner som kräver kortare ljustider och därmed tillåter mer dynamiska cellulära processer att fångas.Noterbart är den nuvarande versionen av PDPL begränsad till den cellulära miljön eftersom den kräver blått ljus och inte kan penetrera djupa vävnader.Denna funktion utesluter dess användning i djurmodellstudier.Men kombinationen av optogenetik med PDPL skulle kunna ge en möjlighet för djurforskning, särskilt i hjärnan.Dessutom tar andra konstruerade infraröda fotosensibilisatorer också bort denna begränsning.Forskning pågår för närvarande inom detta område.
HEK293T-cellinjen erhölls från ATCC (CRL-3216).Cellinjen testade negativt för mykoplasmainfektion och odlades i DMEM (Thermo, #C11995500BT) kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS, Vistech, #SE100-B) och 1 % penicillin/streptomycin (Hyclone, #SV30010).växt in.
3-aminofenylen (prov 3) och (4-etynylfenyl)metanamin (prov 4) köptes från Bidepharm.Propylamin (sond 2) köptes från Energy-chemicals.N-(2-aminofenyl)pent-4-ynamid (prob 1) syntetiserades enligt publicerade metoder.
Kompletterande tabell 1 listar de genetiska konstruktioner som används i denna studie.MiniSOG- och KillerRed-sekvenserna klonades från en presentplasmid från P. Zou (Peking University).Den mitokondriella matrismålsekvensen härleddes från de 23 N-terminala aminosyrorna av COX4 och klonades in i de angivna vektorerna med användning av en Gibson-enhet (Beyotime, #D7010S).För att rikta in sig på membranet och kärnan i det endoplasmatiska retikulumet amplifieras SEC61B humant DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) med PCR från ett cDNA-bibliotek av HEK293T-celler och H2B DNA (donerat av D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) och klonad, som nämnts ovan.Om inget annat anges, PCR-amplifierades andra proteingener som användes för transfektion och konstruktion av stabila cellinjer från HEK293T-cell-cDNA-biblioteket.G3S (GGGS) och G4S (GGGGS) användes som länkar mellan betesproteinet och miniSOG.En V5-epitopmarkör (GKPIPNPLLGLDST) sattes till dessa fusionskonstruktioner.För uttryck i däggdjur och för att etablera en stabil cellinje subklonades miniSOG-fusionskonstruktionen in i den pLX304 lentivirala vektorn.För bakteriell expression klonades miniSOG in i pET21a-vektorn märkt 6xHis vid C-terminalen.
HEK293T-celler såddes med 2,0 x 105 celler per brunn i plattor med sex brunnar och transfekterades 24 timmar senare med rekombinanta lentivirala plasmider (2,4 µg pLX304) och virala förpackningsplasmider (1,5 µg psPAX2 och 1,2 µg psPAX2 och 1,2 µg psPAX2 och 1,2 μg med Lip0μgtime) med Lip0μgtime (Lip0μgtime). , #C0533), cirka 80 % fusion.Efter transfektion över natten byttes mediet och inkuberades i ytterligare 24 timmar.Insamlingen av viruset utfördes efter 24, 48 och 72 timmar.Före infektion av målcellinjerna filtrerades det virala mediet genom ett 0,8 μm filter (Merck, #millex-GP) och polybrene (Solarbio, #H8761) tillsattes till en koncentration av 8 μg/ml.Efter 24 timmar fick cellerna återhämta sig genom att byta medium.Celler selekterades med 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) för de tre första passagerna som ett lägre stringent urval.Använd sedan 20 μg/ml som en strängare regim för de kommande tre passagerna.
Celler såddes i kammare med 12 brunnar (Ibidi, #81201) med en densitet av ungefär 20 000 celler per brunn.För att förbättra vidhäftningen av HEK293T-celler, tillsätt 50 µg/ml fibronektin (Corning, #356008) utspädd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS, Sangon, #B640435) vid 37°C.Kamrarna förbehandlades under 1 timme och avlägsnades sedan med PBS.Efter 24 timmar tvättades cellerna en gång med PBS, inkuberades med 1 mM sond 3 i färsk Hanks balanserade saltlösning (HBSS, Gibco, #14025092) under 1 timme vid 37°C och inkuberades sedan med en blå LED (460 nm) ).10 min vid rumstemperatur.Därefter tvättades cellerna två gånger med PBS och fixerades med 4% formaldehyd i PBS (Sangon, #E672002) under 15 minuter vid rumstemperatur.Överskott av formaldehyd avlägsnades från fixerade celler genom tvättning tre gånger med PBS.Celler permeabiliserades sedan med 0,5 % Triton X-100 (Sangon, #A600198) i PBS och tvättades 3 gånger med PBS.Ta sedan bort kammaren och tillsätt till varje prov 25 µl av en klickreaktionsblandning innehållande 50 µM Cy3-azid (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) och 0,5 mg/ml natriumaskorbat (Aladdin, nr. S105024) och inkuberades i 30 minuter vid rumstemperatur.Efter en snabbreaktion tvättades cellerna sex gånger med PBS innehållande 0,05 % Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) och blockerades sedan med 5 % BSA (Abcone, #B24726) i PBST under 30 minuter vid rumstemperatur.
För immunfärgning av kolokalisering inkuberades celler med primära antikroppar enligt de angivna förhållandena: mus-anti-V5-tagg-mAb (1:500, CST, #80076), kanin-anti-Hsp60-mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), kanin polyklonal anti-calnexin antikropp (1:500, Abcam, #ab22595) eller kanin anti-lamin A/C monoklonal antikropp (1:500; CST, #2032) vid 4 °C över natten.Efter tvätt 3 gånger med PBST inkuberades celler med sekundära antikroppar: get-anti-kanin Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) utspädd 1:1000, get-anti-mus Alexa Fluor 594 (CST, #8889) utspädd 1:1000.spädning Späd vid rumstemperatur i 30 minuter.Cellerna tvättades sedan 3 gånger med PBST och motfärgades med DAPI (Thermo, #D1306) i PBS under 10 minuter vid rumstemperatur.Efter 3 tvättar med PBS förseglades cellerna i 50 % glycerol (Sangon, #A600232) i PBS för avbildning.Immunofluorescerande bilder erhölls med ett ZEISS LSM 900 Airyscan2 konfokalmikroskop och ZNE 3.5-programvara.
För fluorescerande avbildning av singlettsyre tvättades cellerna två gånger med Hanks HEPES-buffert innan 100 nM Si-DMA tillsattes i Hanks HEPES-buffert (DOJINDO, #MT05).Efter exponering för ljus inkuberades cellerna i en CO2-inkubator vid 37°C under 45 minuter.Cellerna tvättades sedan två gånger med Hanks HEPES-buffert och motfärgades med Hoechst i Hanks HEPES-buffert under 10 minuter vid rumstemperatur och visualiserades med ett ZEISS LSM 900 konfokalmikroskop., #M36008) i HBSS-buffert innehållande kalcium och magnesium.Efter exponering för ljus eller doxorubicin (MCE, #HY-15142A) inkuberades celler i en CO2-inkubator vid 37°C under 10 minuter, tvättades två gånger med HBSS-buffert och inkuberades med Hoechst i HBSS-buffert vid rumstemperatur.minuter.Doxorubicin användes som en positiv sondkontroll där celler behandlades med 20 μM doxorubicin i HBSS innehållande 1% BSA i 30 minuter.Immunofluorescerande bilder erhölls med ett Zeiss LSM 900 konfokalmikroskop.
HEK293T-celler som stabilt uttrycker mito-miniSOG såddes med en densitet av cirka 30% i 15 cm skålar.Efter 48 timmar, när ~80% konfluens nåddes, tvättades cellerna en gång med PBS, inkuberades med 1 mM Probe 3 i färsk HBSS-buffert i 1 timme vid 37°C och belystes sedan med en blå LED i 10 minuter i rummet temperatur..Därefter tvättades cellerna två gånger med PBS, skrapades och återsuspenderades i iskall PBS-buffert innehållande EDTA-fria proteashämmare (MCE, #HY-K0011).Celler lyserades genom sonikering av spetsen under 1 minut (1 sekund på och 1 sekund av vid 35 % amplitud).Den resulterande blandningen centrifugerades vid 15 871 xg under 10 minuter vid 4°C för att avlägsna skräp, och supernatantkoncentrationen justerades till 4 mg/ml med användning av ett BCA-proteinanalyskit (Beyotime, #P0009).Kombinera 1 ml av ovanstående lysat med 0,1 mM fotonedbrytbar biotinazid (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA-ligand (Aladdin, #T162437) och 1 mM CuSO4-inkubator med botteninkubator rotera upp i 1 timme vid rumstemperatur.Efter en snabbreaktion, tillsätt blandningen till den förblandade lösningen (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) i en 10 ml glasflaska.Proverna blandades och centrifugerades vid 4500 g under 10 minuter vid rumstemperatur.De undre och övre lösningarna kasserades, fällningen tvättades två gånger med 1 ml metanol och centrifugerades vid 15871 xg under 5 minuter vid 4°C.Tillsätt 1 ml 8 M urea (Aladdin, nr. U111902) i 25 mM ammoniumbikarbonat (ABC, Aladdin, nr. A110539) för att lösa upp fällningen.Prover rekonstituerades med 10 mM ditiotreitol (Sangon, #A100281 i 25 mM ABC) under 40 minuter vid 55°C följt av tillsats av 15 mM färsk jodacetamid (Sangon, #A600539) vid rumstemperatur i mörker.Alkylering inom 30 minuter..Ytterligare 5 mM ditiotreitol tillsattes för att stoppa reaktionen.Förbered cirka 100 µl NeutrAvidin agaroskulor (Thermo, #29202) för varje prov genom att tvätta 3 gånger med 1 ml PBS.Ovanstående proteomlösning späddes med 5 ml PBS och inkuberades med förtvättade NeutrAvidin-agarospärlor under 4 timmar vid rumstemperatur.Pärlorna tvättades sedan 3 gånger med 5 ml PBS innehållande 0,2% SDS (Sangon, #A600485), 3 gånger med 5 ml PBS innehållande 1 M urea och 3 gånger med 5 ml ddH2O.Pärlorna skördades sedan genom centrifugering och återsuspenderades i 200 μl 25 mM ABC innehållande 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) och 20 ng/μl trypsin (Promega, #V5280).Trypsinisera över natten vid 37°C med rotation.Reaktionen stoppades genom tillsats av myrsyra (Thermo, # A117-50) tills pH nådde 2-3.Pärlorna tvättades 3 gånger med 1 ml PBS innehållande 0,2% SDS, 3 gånger med 1 ml PBS innehållande 1 M urea och sedan 3 gånger med 1 ml destillerat vatten.De modifierade peptiderna frigjordes genom lätt lys (365 nm) i 90 minuter med användning av 200 μl 70% MeOH.Efter centrifugering uppsamlades supernatanten.Pärlorna tvättades sedan en gång med 100 μl 70% MeOH och supernatanterna slogs samman.Prover torkades i en Speedvac vakuumkoncentrator och lagrades vid -20°C tills analys.
För att identifiera och kvantifiera singlettsyremodifierade peptider återupplöstes prover i 0,1% myrsyra och 1 μg peptider analyserades med en Orbitrap Fusion Lumos Tribrid-masspektrometer utrustad med en nano ESI-källa från Tune och Xcalibur från leverantörens programvara 4.3.Prover separerades på en 75 µm x 15 cm internt packad kapillärkolonn med 3 µm C18-material (ReproSil-pur, #r13.b9.) och kopplades till ett EASY-nLC 1200 UHPLC-system (Thermo).Peptiderna separerades genom linjär 95 minuters gradientkromatografi från 8 % lösningsmedel B till 50 % lösningsmedel B (A = 0,1 % myrsyra i vatten, B = 0,1 % myrsyra i 80 % acetonitril), ökade sedan linjärt till 98 % B min. på 6 min vid en flödeshastighet av 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos samlar in data växelvis mellan full MS scan och MS2 scan beroende på data.Sputtringsspänningen sattes till 2,1 kV och temperaturen på jontransportkapillären var 320°C.MS-spektra (350-2000 m/z) samlades in med en upplösning på 120 000, AGC 4 × 105 och en maximal ingångstid på 150 ms.De 10 vanligaste multipla laddade prekursorerna i varje full scan fragmenterades med hjälp av HCD med en normaliserad kollisionsenergi på 30 %, ett fyrpolsisoleringsfönster på 1,6 m/z och en upplösningsinställning på 30 000.Ett AGC-mål för tandemmasspektrometri med 5×104 och maximal ingångstid 150 ms.Det dynamiska undantaget är satt till 30 sekunder. Ej tilldelade joner eller de med en laddning på 1+ och >7+ avvisades för MS/MS. Ej tilldelade joner eller de med en laddning på 1+ och >7+ avvisades för MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ej tilldelade joner eller joner med en laddning på 1+ och >7+ avvisades för MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ospecificerade joner eller joner med laddningar på 1+ och >7+ avvisades för MS/MS.
Rådata bearbetas med hjälp av FragPipe datorplattform baserad på MSFragger.Massbias och motsvarande aminosyror bestämdes med användning av en öppen sökalgoritm med en prekursormasstolerans på -150 till 500 Da.Modifierade peptider identifierades sedan med användning av histidinmodifieringar med massökningar på +229,0964 och +247,1069 Da i PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Celler som stabilt uttrycker den fusionerade miniSOG-genen ströks ut i 6 cm skålar.Efter att ha nått ~80% sammanflöde tvättades cellerna en gång med HBSS (Gibco, #14025092), inkuberades sedan med kemiska prober i HBSS under 1 timme vid 37°C och belystes med blått ljus.10W LED i 20 minuter vid rumstemperatur.För att bestämma vilken typ av reaktiv syre som är involverad i PDPL, 0,5 mM vitamin C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 tillsattes till cellerna som tillskott.Efter tvättning med kall PBS skrapades cellerna, samlades i 1,5 ml centrifugrör och sonikerades med en spets under 1 min i 200 μl PBS med 1x proteashämmare utan EDTA (1 s och 1 s utan, amplitud 35%).Den resulterande blandningen centrifugerades vid 15 871 x g under 10 minuter vid 4 °C och supernatantkoncentrationen justerades till 1 mg/ml med användning av ett BCA-proteinanalyskit.Ungefär 50 ul av ovanstående lysat inkuberades med 0,1 mM rhodaminazid (Aladdin, nr. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA-ligand och 1 mM CuS04 under 1 timme vid rumstemperatur med rotation från botten till toppen.Efter klickreaktionen utfördes utfällning med aceton genom att tillsätta 250 μl förkyld aceton till proverna, inkubera vid -20°C i 20 minuter och centrifugera vid 6010×g i 10 minuter vid 4°C.Samla upp pelleten och koka i 50 µl 1x Laemmlis buffert i 10 minuter vid 95 °C.Prover analyserades sedan på SDS-PAGE långa geler och visualiserades med hjälp av Bio-rad ChemiDoc MP Touch-avbildningssystem med Image Lab Touch-mjukvara.
Expression och rening av det rekombinanta miniSOG-6xHis-proteinet utfördes som tidigare beskrivits.Kortfattat transformerades E. coli BL21(DE3)-celler (TransGen, #CD701-02) med pET21a-miniSOG-6xHis och proteinuttryck inducerades med 0,5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Efter cellys renades proteiner med användning av Ni-NTA agaroskulor (MCE, nr 70666), dialyserades mot PBS och förvarades vid -80°C.
För en antikroppsbaserad in vitro-märkningsnärhetsanalys, blanda 100 μM renad miniSOG, 1 mM sond 3 och 1 μg anti-märkt mus monoklonal antikropp (TransGen, #HT501-01) i PBS till en total reaktionsvolym på 50 μl..Reaktionsblandningen bestrålades med blått LED-ljus under 0, 2, 5, 10 och 20 minuter vid rumstemperatur.Blandningen inkuberades med 0,1 mM biotin-PEG3-azid (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA-ligand och 1 mM CuS04 under 1 timme vid rumstemperatur på en skakapparat med uppåtgående rörelse.Efter en snabbreaktion, tillsätt 4x Laemmlis buffert direkt till blandningen och koka vid 95°C i 10 min.Prover analyserades på SDS-PAGE-geler och analyserades genom western blotting med streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
En histidininnehållande syntetisk peptid med C-terminal amidering (LHDALDAK-CONH2) användes för att analysera närliggande peptidbaserad in vitro-märkning.I denna analys blandades 100 μM renad miniSOG, 10 mM prob 3 och 2 μg/ml syntetisk peptid i PBS i en total reaktionsvolym på 50 μl.Reaktionsblandningen bestrålades med blått LED-ljus under 1 timme vid rumstemperatur.En mikroliter prov analyserades med användning av ett LC-MS-system (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight masspektrometer med MassLynx spektrumanalysmjukvara).
HEK293T-celler som stabilt uttrycker miniSOG-fusionsgenen såddes i 10 cm skålar för linjer med olika organelllokalisering (Mito, ER, Nucleus) och 15 cm skålar för Parkin-miniSOG- och BRD4-miniSOG-linjer.Efter att ha nått ~90% sammanflöde tvättades cellerna en gång med HBSS, inkuberades sedan med sond 3 i HBSS under 1 timme vid 37°C och belystes med en 10 W blå LED vid rumstemperatur.För beröringsfri märkning av Parkin tillsattes 10 µM protonkarbonylcyanidbärare m-klorfenylhydrazon CCCP (Solarbio, #C6700) med sond 3 i HBSS under 1 timme vid 37°C.Celllysen, klickkemin, reduktionen och alkyleringsstegen var desamma som beskrivits ovan, förutom att 2 mg lysat tillsattes och biotin PEG3-azid användes i klickreaktionen istället för fotonedbrytbar biotinazid.Efter anrikning tvättades pärlorna 3 gånger med 5 ml PBS innehållande 0,2% SDS, 3 gånger med 5 ml PBS innehållande 1 M urea och 3 gånger med 5 ml PBS.Därefter sattes 2 µg trypsin till 300 ul 25 mM ABC innehållande 1 M urea för att klyva proteinet över natten vid 37°C.Reaktionen stoppades genom tillsats av myrsyra tills ett pH av 2-3 uppnåddes.Efter trypsinisering på pärlor avsaltades peptidlösningen med användning av en SOLAµ HRP-kolonn (Thermo, #60209-001) och torkades i en Speedvac-vakuumkoncentrator.Peptider återupplöstes i 0,1 % myrsyra och 500 ng peptider analyserades med användning av en Orbitrap Fusion Lumos Tribrid-masspektrometer utrustad med nano-ESI-källan beskriven ovan.Peptider separerades på kommersiella RP-HPLC-prekolonner (75 μm x 2 cm) (Thermo, nr 164946) och analytiska RP-HPLC-kolonner (75 μm x 25 cm) (Thermo, nr 164941), båda fyllda med 2 μm.gradient från 8 % till 35 % ACN på 60 minuter, ökade sedan linjärt till 98 % B på 6 minuter vid en flödeshastighet av 300 Nl/min.MS-spektra (350-1500 m/z) samlades in med en upplösning på 60 000, AGC 4 × 105 och en maximal ingångstid på 50 ms.Utvalda joner fragmenterades sekventiellt av HCD i 3 s cykler med en normaliserad kollisionsenergi på 30 %, ett fyrpoligt isoleringsfönster på 1,6 m/z och en upplösning på 15 000. Ett 5 × 104 tandem masspektrometer AGC mål och en maximal injektionstid på 22 ms användes.Den dynamiska uteslutningen är inställd på 45 sekunder. Ej tilldelade joner eller de med en laddning på 1+ och >7+ avvisades för MS/MS. Ej tilldelade joner eller de med en laddning på 1+ och >7+ avvisades för MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ej tilldelade joner eller joner med en laddning på 1+ och >7+ avvisades för MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ospecificerade joner eller joner med laddningar på 1+ och >7+ avvisades för MS/MS.
Provberedningsstegen fram till anrikningen av NeutrAvidin-pärlorna var desamma som i LC-MS/MS-analysen som beskrivs ovan.Ungefär 50 μg lysat användes som input för laddningskontroll och 2 mg lysat användes för klickreaktioner.Efter anrikning och tvättning med neutravidin eluerades de bundna proteinerna genom att tillsätta 50 μl av Laemmlis buffert till agaroshartspärlorna och koka vid 95°C i 5 minuter.Kontrollbelastningsinmatning och pärlanrikade prover analyserades med SDS-PAGE och överfördes till PVDF-membran (Millipore, #ISEQ00010) med standard Western blot-metoder.Membranen blockerades med 5 % skummjölk (Sangon, #A600669) i TBS innehållande 0,1 % tween-20 (TBST) och inkuberades sekventiellt med primära och sekundära antikroppar.Primära antikroppar späddes 1:1000 i 5 % skummjölk i TBST och inkuberades över natten vid 4°C.Sekundära antikroppar användes i ett förhållande av 1:5000 och inkuberades under 1 timme vid rumstemperatur.Membranen visualiserades genom kemiluminescens med användning av Chemidoc MP-avbildningssystemet.Alla oklippta skanningar av blottar och geler i figuren presenteras som rådata.
Primära antikroppar som användes i denna studie inkluderade kanin anti-SFPQ monoklonal antikropp (CST, nr 71992), kanin anti-FUS monoklonal antikropp (CST, nr 67840), kanin anti-NSUN2 polyklonal antikropp (Proteintech, nr 20854-1) AP), kanin anti-mSin3A polyklonal antikropp (Abcam, #ab3479), mus anti-tag monoklonal antikropp (TransGen, #HT201-02), mus anti-β-aktin monoklonal antikropp (TransGen, #HC201-01), kanin anti -CDK2 monoklonal antikropp (ABclonal, #A0094), monoklonal kaninantikropp mot CTBP1 (ABclonal, #A11600), polyklonal kaninantikropp mot DUT (ABclonal, #A2901), polyklonal kaninantikropp mot PS5, #ABrbit-antikropp mot PS5, #A250nal- DNAJB1 polyklonal antikropp (ABclonal, # A5504).Dessa antikroppar användes i en 1:1000 utspädning i 5 % skummjölk i TBST.De sekundära antikropparna som användes i denna studie inkluderade anti-kanin-IgG (TransGen, #HS101-01), anti-mus-IgG (TransGen, #HS201-01) i en spädning av 1:5000.
För att ytterligare undersöka om BRD4 interagerar med SFPQ, pläterades stabila HEK293T- och BRD4-miniSOG-celler som överuttrycker HEK293T i 10 cm skålar.Celler tvättades med kall PBS och lyserades i 1 ml Pierce IP-lysbuffert (Thermo Fisher, #87787) med EDTA-fri proteashämmare under 30 minuter vid 4°C.Därefter uppsamlades lysaten i 1,5 ml centrifugrör och centrifugerades vid 15 871 xg under 10 minuter vid 4°C.Supernatanten skördades och inkuberades med 5 µg anti-V5-märkt monoklonal musantikropp (CST, #80076) över natten vid 4°C.Tvätta cirka 50 µl protein A/G magnetiska pärlor (MCE, #HY-K0202) två gånger med PBS innehållande 0,5 % Tween-20.Sedan inkuberades cellysaten med magnetiska pärlor under 4 timmar vid 4°C med rotation från botten till toppen.Därefter tvättades pärlorna fyra gånger med 1 ml PBST-buffert och kokades vid 95°C under 5 min.Prover analyserades på SDS-PAGE-geler och överfördes till PVDF-membran med användning av standardmetoder för Western blot.Membranen blockerades i 5 % skummjölk i TBST och inkuberades sekventiellt med primära och sekundära antikroppar.Primär antikropp Kanin anti-SFPQ monoklonal antikropp (CST, #71992) användes i ett förhållande av 1:1000 i 5 % skummjölk i TBST och inkuberades över natten vid 4°C.Anti-kanin IgG användes i ett förhållande av 1:5000 och inkuberades under 1 timme vid rumstemperatur.Membranen visualiserades genom kemiluminescens med användning av Chemidoc MP-avbildningssystemet.
Alla strukturer som användes för analysen av lösningsmedelstillgänglig ytarea (SASA) erhölls från Protein Data Bank (PDB)52 eller AlphaFold Protein Structure Database53.Absolut SASA beräknades för varje rest med hjälp av FreeSASA-programmet.Endast fullständiga och entydiga SASA-data för märkt histidin och dess grannar användes för att erhålla medelvärdet för SASA för varje struktur.Den relativa lösningsmedelstillgängligheten (RSA) för varje histidin beräknades genom att dividera det absoluta SASA-värdet med den empiriska maximala möjliga restytan tillgänglig för lösningsmedlet.Alla histidiner klassificerades sedan som dolda om medel-RSA var under 20 %, annars exponerade56.
Råfiler erhållna i DDA-läge söktes med Proteome Discoverer (v2.5) eller MSfragger (Fragpipe v15.0) i lämplig SwissProt-verifierad proteindatabas som innehåller vanliga föroreningar.Peptiderna krävde komplett trypsin med två saknade klyvningsställen, karbamoylmetylering som en fixerad modifiering och metioninoxidation som en dynamisk modifiering.Prekursor- och fragmentviktstoleranser sattes till 10 ppm respektive 0,02 Da (MS2 Orbitrap). Föroreningsträffar togs bort och proteiner filtrerades för att erhålla en falsk upptäcktsfrekvens på <1 %. Föroreningsträffar togs bort och proteiner filtrerades för att erhålla en falsk upptäcktsfrekvens på <1 %. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфициент коэфициент. Föroreningsträffar avlägsnades och proteinerna filtrerades för att ge en falsk detekteringsgrad på <1 %.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1 %的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы för достижения уровня ложных <1%. Föroreningsträffar togs bort och proteiner filtrerades för att uppnå en falsk positiv frekvens på <1 %.För kvantitativ analys utan användning av märkningar användes normaliserat proteininnehåll från tre biologiska upprepningar.Protein subcellulär lokaliseringsanalys utfördes med hjälp av Gene Ontology (GO) analys från DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 och databaser sammanställda och publicerade av Alice Ting-gruppen.Vulkankartan erhölls från Perseus (v1.6.15.0). Proteinöverflödsfaldiga förändringar testades för statistisk signifikans med användning av ett tvåsidigt t-test, och proteinträffar identifierades med överflödsförändring >2 (om inget annat anges) och p-värde <0,05. Proteinöverflödsfaldiga förändringar testades för statistisk signifikans med användning av ett tvåsidigt t-test, och proteinträffar identifierades med överflödsförändring >2 (om inget annat anges) och p-värde <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Förändringar i proteininnehållet testades för statistisk signifikans med användning av ett tvåsidigt t-test, och proteinmatchningar identifierades med innehållsförändring >2 (om inget annat anges) och ap-värde <0,05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （除非 另 有 说明） p 值 <0,05。使用 双边 T 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 p 值 <0,05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Statistisk signifikans av veckförändringar i proteininnehåll testades med ett tvåsidigt t-test, och proteinmatchningar bestämdes för innehållsförändringar >2 (om inget annat anges) och p-värden <0,05.Proteininteraktionsanalys utfördes med GO-analys tillsammans med String-databasen.
Tre biologiska replikat utfördes med liknande resultat.Statistisk analys gjordes med GraphPad Prism (GraphPad programvara) och vulkanplottar genererades med Perseus (v1.6.15.0).För att jämföra de två grupperna bestämdes p-värden med hjälp av ett tvåsidigt Students t-test.Endast singletonproteiner identifierade minst två gånger i experimentgruppen inkluderades i vulkanplotterna, och motsvarande saknade värden i kontrollgruppen ersattes med Perseus från en normalfördelning så att p-värdet kunde beräknas.Felstaplar representerar medelvärdet ± standardavvikelsen.I proteomiska analyser för statistisk analys bibehölls mängden proteiner som förekom i minst två biologiska replikat.Statistiska metoder användes inte för att förbestämma provstorleken.Experimenten är inte slumpmässiga.Forskarna var inte blinda för uppgifterna under experimentet och utvärderingen av resultaten.
För mer information om studiedesign, se Nature Research Report abstract länkat till denna artikel.
Masspektrometridata som erhölls i denna studie skickades till ProteomeXchange Consortium via iProX57-partnerförrådet under datauppsättnings-ID PXD034811 (PDPL-MS-datauppsättning).Rådata tillhandahålls i form av rådatafiler.Den här artikeln innehåller de ursprungliga uppgifterna.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Att lära känna grannskapet: använda närhetsberoende biotinylering för att karakterisera proteinkomplex och kartlägga organeller. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Att lära känna grannskapet: använda närhetsberoende biotinylering för att karakterisera proteinkomplex och kartlägga organeller.Gingras, AS, Abe, KT och Raut, B. Förtrogenhet med omgivningen: användning av närhetsberoende biotinylering för att karakterisera proteinkomplex och kartlägga organeller. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Förstå grannskapet: använd grannskapets beroende av biologiskt liv.Gingras, AS, Abe, KT och Raut, B. Förstå närhet: karakterisering av proteinkomplex och kartläggning av organeller med hjälp av närhetsberoende biotinylering.Nuvarande.Min åsikt.Kemisk.biologi 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Kartläggning av mikromiljön genom att överföra Dexter-energi till immunceller.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Nätverk i två proteomskala upptäcker cellspecifik ombyggnad av den mänskliga interaktomen.Cells 184, 3022–3040.e3028 (2021).