Traditionella diagnostiska strategier för att upptäcka infektionssjukdomar kräver användning av bänkinstrument som inte är lämpliga för point-of-care testing (POCT).Emerging microfluidics är en mycket miniatyriserad, automatiserad och integrerad teknologi som är ett potentiellt alternativ till traditionella metoder för snabb, låg kostnad och exakt diagnostik på plats.Molekylära diagnostiska metoder används i stor utsträckning i mikrofluidiska anordningar som de mest effektiva metoderna för att upptäcka patogener.Denna recension sammanfattar de senaste framstegen inom mikrofluidbaserad molekylär diagnostik av infektionssjukdomar ur både ett akademiskt och industriellt perspektiv.Först beskriver vi en typisk on-chip-bearbetning av nukleinsyror, inklusive provförbehandling, amplifiering och signalavläsning.Sedan jämförs egenskaperna, fördelarna och nackdelarna med de fyra typerna av mikrofluidiska plattformar.Därefter kommer vi att diskutera användningen av digitala analyser för den absoluta kvantifieringen av nukleinsyror.Både klassiska och nya kommersiella mikrofluidikbaserade molekylärdiagnostiska enheter sammanfattas som bevis på det nuvarande tillståndet på marknaden.Slutligen föreslår vi framtida riktningar för mikrofluidisk diagnostik av infektionssjukdomar.
Infektionssjukdomar orsakas av patogener, inklusive bakterier, virus och parasiter, som är spridda över hela världen.Till skillnad från andra sjukdomar blir patogener snabbt infekterade och sprids mellan människor och värddjur genom inokulering, luft och vattenmedia [1].Förebyggande av infektionssjukdomar är avgörande som en folkhälsoåtgärd.Tre huvudstrategier för att bekämpa infektionssjukdomar: (1) kontrollera infektionskällan;(2) avbrott av överföringsvägen;(3) skydd av mottagliga populationer.Bland huvudstrategierna anses kontroll av infektionskällan vara den viktigaste strategin på grund av dess bekvämlighet och låga kostnad.Snabb diagnos, isolering och behandling av infekterade individer är avgörande och kräver snabba, känsliga och noggranna diagnostiska strategier [2].Den nuvarande diagnosen av infektionssjukdomar kombinerar vanligtvis klinisk undersökning baserad på tecken och symtom och laboratoriestudier såsom cellodling och molekylär diagnostik, som kräver utbildad personal, arbetsintensiva procedurer och dyr testutrustning [3, 4].Förebyggande av utbrott av infektionssjukdomar kräver snabb, billig och korrekt lokal diagnos, särskilt i resursbegränsade områden där infektionssjukdomar är vanliga och allvarliga [5], samt behandling i vildmarken eller på slagfältet, där nödsituationer är oförutsägbara..sjukvården är begränsad [6].I detta sammanhang är mikrofluidik en teknik som kombinerar mikroelektromekaniska systemteknologier, nanoteknik eller materialvetenskap för exakt vätskemanipulation [7,8,9,10], vilket ger nya möjligheter för point-of-care-detektion (POCT).) smittämnen utanför sjukhus och laboratorier.Jämfört med traditionell tidskrävande diagnostik erbjuder mikrofluidikteknik prov- och kostnadsbesparingar för molekylär diagnostik under sjukdomsutbrott.Den globala spridningen av coronavirus sjukdom 2019 (COVID-19) orsakas av allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), så vikten av mikrofluidik för att förebygga och kontrollera pandemin i tid betonas återigen [11, 12 , 13].Till skillnad från traditionell diagnostik använder mikrofluidisk POCT små bärbara enheter, allt från bänkanalysatorer till små sidoströmstestremsor för att testa nära provtagningspunkten [14].Dessa tester har förenklade eller inga provförberedelser, snabb signalförstärkning och känsliga signalavläsningar som resulterar i kort varaktighet och exakta resultat inom några minuter.Tillgängligheten och massproduktionen av mikrofluidbaserade sjukvårdsinstrument har utökat deras kostnadseffektiva och direkta diagnostiska tillämpningar utanför sjukhuset, nära patienten och till och med hemma.
Bland de befintliga strategierna för att diagnostisera infektionssjukdomar är molekylär diagnostik en av de mest känsliga [15, 16].Dessutom används molekylär diagnostik ofta som guldstandarden för kontinuerlig detektering av COVID-19, vilket möjliggör direkt detektering av virusspecifika regioner av RNA eller DNA innan ett immunsvar börjar [17, 18].I den aktuella översikten presenterar vi de senaste framstegen inom mikrofluidikbaserade molekylära diagnostiska processer för infektionssjukdomar, från ett akademiskt perspektiv till framtida industriella perspektiv (Fig. 1).Vi kommer att börja med tre nyckelsteg i nukleinsyradetektion: förbehandling av prov på chip, nukleinsyraamplifiering och signalavläsning.Vi jämförde sedan olika typer av mikrofluidiska plattformar med deras struktur och funktion, och visade unika egenskaper (styrkor och svagheter).Digital nukleinsyradetektion diskuteras vidare och ges som ett exempel på en tredje generationens teknologi för absolut kvantifiering av infektiösa patogenmolekyler.Dessutom kommer flera typiska och senaste kommersiella POCT-enheter att presenteras för att demonstrera det aktuella läget för den mikrofluidiska POCT-marknaden för molekylär diagnostik.Vi kommer också att diskutera och förklara vår vision för framtida ansökningar.
Moduler av mikrofluidchip för nukleinsyradetektion kan delas in i tre kategorier (provtagning, igenkänning och signalering) enligt deras funktioner [19].Bland dessa moduler realiserar provtagningsmodulen huvudsakligen provlys och nukleinsyraextraktion.Sensormodulen styr huvudsakligen omvandlingen och amplifieringen av nukleinsyrasignaler.Signaleringsmodulen detekterar signalen som omvandlas och bearbetas av avkänningsmodulen.Baserat på processen att detektera nukleinsyror på ett chip, kommer vi att sammanfatta de olika chipen som kan realisera funktionen "input och output".
Det första steget i nukleinsyradetektion är nukleinsyraextraktion, dvs. isolering av målnukleinsyran från det ursprungliga provet.Nukleinsyraextraktion utförs för att rena nukleinsyror från andra molekylära föroreningar, säkerställa integriteten hos den primära strukturen av nukleinsyramolekyler och optimera resultaten.Nukleinsyraextraktion kräver nödvändig provlys och nukleinsyrainfångning, vars kvalitet och effektivitet har en enorm inverkan på forskning och diagnostiska resultat.Eventuella subtila biverkningar under extraktion kan begränsa ytterligare upptäckt.Till exempel hämmas polymeraskedjereaktion (PCR) och loop isotermisk amplifiering (LAMP) metoder av vissa kvarvarande organiska lösningsmedel såsom etanol och isopropanol i nukleinsyraisoleringsreagens [20].Vätske-vätskeextraktion och fastfasextraktion är de mest populära metoderna för att isolera nukleinsyror [21], men vätske-vätskeextraktion på ett chip är extremt begränsad, eftersom reagenserna som används vid vätske-vätskeextraktion orsakar korrosion av de flesta mikrofluidiska chip .Här lyfter vi fram mikroarraybaserade fastfasextraktionsmetoder och jämför deras fördelar och nackdelar.
Kisel är ett substratmaterial som är kompatibelt med nukleinsyror på grund av dess biokompatibilitet, stabilitet och lätthet att modifiera [22].Viktigt, när den modifieras med kiseldioxid eller andra material, uppvisar denna komposit egenskaper att adsorbera negativt laddade nukleinsyror under lågt pH, höga saltförhållanden samtidigt som den eluerar med högt pH, låga saltlösningar.Baserat på detta fenomen är det möjligt att rena nukleinsyran.
Olika former av kiseldioxidbaserade material har använts för nukleinsyraextraktion i mikrofluidik, såsom kiselpärlor, pulver, mikrofiberfilter och kiseldioxidmembran [23, 24, 25, 26].Beroende på materialets egenskaper kan silikonbaserade material användas i mikrokretsar på olika sätt.Till exempel kan kiseldioxidgranuler, pulver och kommersiella nanofilter helt enkelt placeras i porerna eller mikrokanalerna på mikrofluidchip och hjälpa till att extrahera nukleinsyror från prover [27, 28, 29].Ytmodifierade kiseldioxidmembran kan också användas för att snabbt rena DNA från patogener till låg kostnad.Till exempel, Wang et al.[30] Genom att kombinera denaturerande amplifieringsreaktioner med vesikelmedierat kedjeutbyte med kiselmembran belagda med kitosanoligosackarider, introducerades ett mångsidigt bärbart system som framgångsrikt detekterade 102–108 kolonibildande enheter.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., och närvaron av viruset var lätt synlig.Powell et al.[31] Kiselbaserade mikroarrayer användes sedan för att detektera hepatit C-virus (HCV), humant immunbristvirus (HIV), Zika-virus och humant papillomvirus och automatisk förökning, i vilken en 1,3 μl slingrande mikroreaktor utvecklades för att fånga RNA-virus.och utföra in situ-förstärkning.Utöver dessa metoder spelar ytmodifierade kiseldioxidmikrokolonner också en nyckelroll vid nukleinsyraextraktion, eftersom geometrin och egenskaperna hos det modifierande materialet avsevärt ökar extraktionseffektiviteten.Chen et al.[32] föreslog en mikrofluidisk plattform för isolering av RNA med låg koncentration baserad på aminobelagda kiselmikrokolonner.Denna mikrofluidiska enhet integrerar en array av 0,25 cm2 mikropelare på ett kiselsubstrat för att uppnå högre extraktionseffektivitet genom en design med högt förhållande mellan ytarea och volym.Fördelen med denna design är att den mikrofluidiska enheten kan uppnå upp till 95 % nukleinsyraextraktionseffektivitet.Dessa kiselbaserade strategier visar värdet av att snabbt isolera nukleinsyror till låg kostnad.I kombination med mikrofluidiska chips kan kiselbaserade extraktionsstrategier inte bara öka effektiviteten av nukleinsyradetektering, utan också underlätta miniatyrisering och integration av analytiska enheter [20].
Magnetiska separationsmetoder använder magnetiska partiklar för att isolera nukleinsyror i närvaro av ett externt magnetfält.Vanligt använda magnetiska partiklar inkluderar Fe3O4 eller y-Fe2O3 magnetiska partiklar belagda med kiseldioxid, amino och karboxyl [33,34,35,36].Den utmärkande egenskapen hos magnetiska partiklar jämfört med kiselbaserade SPE-metoder är lättheten att manipulera och kontrollera med externa magneter.
Genom att använda den elektrostatiska interaktionen mellan nukleinsyror och kiseldioxid, under förhållanden med högt salt och lågt pH, adsorberas nukleinsyror på ytan av kiseldioxidbelagda magnetiska partiklar, medan under förhållanden med lågt salt och högt pH kan molekylerna tvättas om igen..Kiseldioxidbelagda magnetiska pärlor gör det möjligt att extrahera DNA från prover med stora volymer (400 μL) med hjälp av magnetiskt kontrollerad rörelse [37].Som en demonstration, Rodriguez-Mateos et al.[38] använde avstämbara magneter för att kontrollera överföringen av magnetiska pärlor till olika kammare.Baserat på kiseldioxidbelagda magnetiska partiklar kan 470 kopior/ml av genomiskt RNA från SARS-CoV-2 extraheras från avloppsvattenprover för LAMP omvänd transkriptionsdetektion (RT-LAMP) och svaret kan avläsas inom 1 timme.blotta ögat (fig. 2a).
Enheter baserade på magnetiska och porösa material.Konceptuellt diagram av IFAST RT-LAMP mikrofluidisk enhet för SARS-CoV-2 RNA-detektion (anpassad från [38]).b Centrifugalmikroanordning för dSPE av nukleinsyra med buckal pinne (anpassad från [39]).c Inbyggd självförsörjande provkoncentrator med ett FTA®-kort (anpassad från [50]).d Fusion 5 filterpapper modifierat med kitosan (anpassad från [51]).SARS-CoV-2 allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2, RT-LAMP omvänd transkriptionsloop-medierad isotermisk amplifiering, FTA finders teknologipartners, NA nukleinsyra
Positivt laddade magnetiska partiklar är idealiska för att fästa fosfatryggraden i en nukleinsyra.Vid en viss saltkoncentration kan de negativt laddade fosfatgrupperna i nukleinsyror vara positivt laddade på ytan av de magnetiska kompositpartiklarna.Därför utvecklades magnetiska nanopartiklar med en grov yta och en hög täthet av aminogrupper för extraktion av nukleinsyror.Efter magnetisk separation och blockering kan magnetiska nanopartiklar och DNA-komplex användas direkt i PCR, vilket eliminerar behovet av komplexa och tidskrävande renings- och elueringsoperationer [35].Magnetiska nanopartiklar belagda med negativa karboxylgrupper har också använts för att separera nukleinsyror adsorberade på ytor i högkoncentrationslösningar av polyetylenglykol och natriumklorid [36].Med dessa ytmodifierade magnetiska pärlor är DNA-extraktion kompatibel med efterföljande amplifiering.Dignan et al.[39] beskrev en automatiserad och portabel centrifugalmikrofluidisk plattform för nukleinsyraförbehandling, vilket gör det möjligt för icke-teknisk personal att använda den på plats.Dessutom visar kompatibiliteten av det isolerade DNA:t med LAMP, en metod som är väl lämpad för nukleinsyraanalys på plats, ytterligare minimala utrustningskrav och lämplighet för kolorimetriska analyser (Fig. 2b).
Magnetiska pärlmetoder erbjuder möjligheten till automatiserad extraktion, av vilka några finns i kommersiella automatiserade nukleinsyraextraktorer [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, USA), QIAcube® HT;CapitalBio (Peking, Kina) och Biomek®;Beckman (Miami, USA).), Florida, USA)].Fördelarna med att kombinera magnetiska pärlor med mikrofluidik kan användas för effektiv automatiserad extraktion av nukleinsyror, vilket potentiellt skulle kunna främja utvecklingen av molekylär diagnostik;Men kombinationen av magnetiska pärlor med mikrofluidik är fortfarande starkt beroende av komplexa kontrollsystem för exakt manipulering av magnetiska pärlor, vilket förklarar populariteten för kommersiella produkter som är skrymmande och dyra, vilket begränsar ytterligare tillämpning av magnetiska pärlor i POCT.
Flera porösa material som modifierade nitrocellulosafilter, Finders Technology Associates (FTA)-kort, polyetersulfonbaserade filterpapper och glykanbelagda material har också använts för nukleinsyradetektering [40, 41, 42, 43, 44].Porösa fibrösa material som fibröst papper användes först för att isolera DNA genom att fysiskt intrassla långsträngade DNA-molekyler med fibrer.Små porer leder till en stark fysisk begränsning av DNA-molekyler, vilket positivt påverkar DNA-extraktionen.På grund av de olika porstorlekarna hos fibröst papper kan extraktionseffektiviteten inte tillgodose behoven av DNA-amplifiering [45, 46].FTA-kortet är ett kommersiellt filterpapper som används inom rättsmedicin och används ofta inom andra områden av molekylär diagnostik.Genom att använda cellulosafilterpapper impregnerat med olika kemikalier för att lysera cellmembranen i provet skyddas det frigjorda DNA:t från nedbrytning i upp till 2 år.På senare tid har impregnerat cellulosapapper utvecklats för molekylär detektion av olika patogener, inklusive SARS-CoV-2, leishmaniasis och malaria [47,48,49].HIV i den isolerade plasman lyseras direkt och den virala nukleinsyran anrikas i FTA®-flödesmembranet inbyggt i koncentratorn, vilket möjliggör effektiv produktion av nukleinsyran [50] (Fig. 2c).Det största problemet med nukleinsyradetektering med FTA-kort är att kemikalier som guanidin och isopropanol hämmar efterföljande amplifieringsreaktioner.För att lösa detta problem utvecklade vi Fusion 5 kitosanmodifierat filterpapper, som kombinerar fördelarna med både fysisk sammanflätning av DNA-molekyler och fibröst filterpapper, och elektrostatisk adsorption av DNA på kitosanmodifierade föreningar för att uppnå mycket effektiv nukleinsyraextraktion ..filterfibrer [51] (fig. 2d).På liknande sätt har Zhu et al.[52] demonstrerade en kitosanmodifierad PCR-metod baserad på ett in situ kapillärt mikrofluidsystem för snabb isolering och detektion av Zika-virus-RNA.Nukleinsyror kan adsorberas/desorberas i ett blandat lysat/PCR-medium, baserat på kitosans på/av-brytaregenskaper.på och av”, känslig för pH.
Som nämnts ovan kombinerar dessa strategier fördelarna med olika fastfasmaterial och ökar effektiviteten av nukleinsyraextraktion i mikrofluidik.I praktiska tillämpningar är användningen av dessa material i stora mängder oekonomisk, och korrekt ytbehandling eller ytmodifiering av vanliga material med dessa material kan också bevara deras funktion.Därför tror man att implementeringen av dessa strategier efter en pilotstudie kan minska kostnaderna.
Nukleinsyratestning på mikrofluidiska plattformar använder ofta små provvolymer (< 100 µl), kräver därför amplifiering av målnukleinsyrorna med specifika prober för omvandling till en signal som är bekväm för nedströmsdetektering (optisk, elektrisk och magnetisk) [53, 54]. Nukleinsyratestning på mikrofluidiska plattformar använder ofta små provvolymer (< 100 µl), kräver därför amplifiering av målnukleinsyrorna med specifika prober för omvandling till en signal som är bekväm för nedströmsdetektering (optisk, elektrisk och magnetisk) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Vid testning av nukleinsyror på mikrofluidiska plattformar används ofta små provvolymer (<100 µL), så amplifiering av målnukleinsyror med speciella prober krävs för att omvandla den till en signal som är lämplig för efterföljande detektion (optisk, elektrisk och magnetisk) [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 （<100 ul） ， 因此 需要 使用 特定 探针 扩增 目标 核酸 ， 以 为 便于 下游 检测 （、 电学 和 探针 扩增 目标 核酸 核酸 核酸 核酸 以 转换 为 便于 下游 检测 （、 电学 和 特定 探针 扩增 目标 核酸 核酸 核酸 核酸 核酸 以 便于 下游 下游 检测 （光学 电学 和 磁学） 探针 的 信号 [53, 54 ].微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 ul） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 为 下游 下游 （光学 、 磁学） 信号 信号 信号 [53, 54, 54, 54 ]. Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Detektion av nukleinsyror på mikrofluidiska plattformar använder vanligtvis små provvolymer (<100 μl), vilket kräver amplifiering av målnukleinsyror med speciella prober för att omvandla dem till signaler för efterföljande detektion (optisk, elektrisk och magnetisk) [53, 54]] .Nukleinsyraamplifiering i mikrofluidik kan också påskynda reaktioner, optimera detektionsgränser, minska provkraven och förbättra detektionsnoggrannheten [55, 56].Under de senaste åren, med förverkligandet av snabb och exakt detektion, har olika nukleinsyraamplifieringsmetoder använts i mikrofluidik, inklusive PCR och vissa isotermiska amplifieringsreaktioner.Detta avsnitt kommer att sammanfatta metoder för nukleinsyradetektering baserade på mikrofluidiska system.
PCR är en simulering av DNA-replikationsprocessen hos en organism, vars teori beskrivs i detalj på annat håll och kommer inte att diskuteras här.PCR kan amplifiera en mycket liten mängd mål-DNA/RNA i en exponentiell hastighet, vilket gör PCR till ett kraftfullt verktyg för snabb detektion av nukleinsyror.Under de senaste decennierna har många bärbara mikrofluidiska enheter utrustade med PCR-termiska cyklingssystem utvecklats för att möta behoven av point-of-care diagnostik [57, 58].On-chip PCR kan delas in i fyra typer (konventionell, kontinuerligt flöde, rumsligt omkopplad och konvektiv PCR) enligt olika temperaturkontrollmetoder [59].Till exempel, Gee et al.[60] utvecklade en kvantitativ PCR-metod (RT-qPCR) för direkt omvänd transkription på sin egen mikrofluidiska plattform för multiplexdetektering av SARS-CoV-2, influensa A- och B-virus i svalgprover (Fig. 3a).Park et al.[61] byggde ett enkelt patogenanalyschip genom att integrera tunnfilms-PCR, elektroder och en fingerstyrd polydimetylsiloxan-baserad mikrofluidmodul.Båda verken förkroppsligar dock de vanliga bristerna hos konventionell PCR.PCR kräver termisk cykling, vilket begränsar ytterligare enhetsminiatyrisering och minskad testtid.
Utvecklingen av kontinuerligt flödesbaserad mikrofluidisk och rymdswitchad PCR är avgörande för att lösa detta problem.Genom att använda en lång serpentinkanal eller en kort rak kanal kan PCR med kontinuerligt flöde ge snabb amplifiering genom att aktivt cirkulera reagenser i tre förvärmningszoner med en off-chip-pump.Denna operation undviker framgångsrikt övergångsfasen mellan olika reaktionstemperaturer och minskar således testtiden avsevärt [62] (Fig. 3b).I en annan studie av Jung et al.[63] föreslog en ny roterande genetisk PCR-analysator som kombinerar egenskaperna hos fixerad och flödes-PCR för ultrasnabb och multiplex omvänd transkriptions-PCR (Fig. 3c).För nukleinsyraamplifiering kommer PCR-mikrochipet att roteras genom tre värmeblock vid olika temperaturer: 1. Denatureringsblock 94°C, 2. Glödgningsblock vid 58°C, 3. Expansionsblock vid 72°C.
Tillämpning av PCR i mikrofluidik.Schematisk representation av dirRT-qPCR på en mikrofluidisk plattform (anpassad från [60]).b Schematisk representation av ett kontinuerligt flöde PCR-mikroarray baserat på en serpentinkanal (anpassad från [62]).c Schematisk representation av en roterande genetisk PCR-analysator, bestående av ett mikrochip, tre värmeblock och en stegmotor (anpassad från [63]).d Diagram över termokonvektion PCR med centrifugering och inställning (anpassad från [64]).DirRT-qPCR, direkt kvantitativ omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion
Genom att använda kapillärer och slingor eller till och med tunna plattor kan konvektions-PCR snabbt amplifiera nukleinsyror genom naturlig fri termisk konvektion utan behov av en extern pump.Till exempel utvecklades en mikrofluidisk plattform för cyklisk olefinpolymer på ett tillverkat roterande värmesteg som använder termisk cykling med centrifugering i en PCR-loopmikrokanal [64] (Fig. 3d).Reaktionslösningen drivs av termisk konvektion, som kontinuerligt växlar hög och låg temperatur i en mikrokanal med ringformig struktur.Hela amplifieringsprocessen kan slutföras på 10 minuter med en detektionsgräns på 70,5 pg/kanal.
Som väntat är snabb PCR ett kraftfullt verktyg för helt integrerade provsvarsmolekylär diagnostik och multiplexanalyssystem.Snabb PCR minskar avsevärt tiden som krävs för att upptäcka SARS-CoV-2, vilket bidrar till effektiv kontroll av covid-19-pandemin.
PCR kräver en komplex termisk cykler som inte är lämplig för POCT.På senare tid har isotermiska amplifieringstekniker tillämpats på mikrofluidik, inklusive men inte begränsat till LAMP, rekombinaspolymerasamplifiering (RPA) och amplifiering baserad på nukleinsyrasekvenser [65,66,67,68].Med dessa tekniker amplifieras nukleinsyror vid en konstant temperatur, vilket underlättar skapandet av billiga, mycket känsliga bärbara POCT-enheter för molekylär diagnostik.
Mikrofluidikbaserade LAMP-analyser med hög genomströmning möjliggör multipel upptäckt av infektionssjukdomar [42, 69, 70, 71].I kombination med ett centrifugalt mikrofluidsystem kan LAMP ytterligare underlätta automatiseringen av nukleinsyradetektion [69, 72, 73, 74, 75].Spin-and-react SlipChip utvecklades för visuell detektering av flera parallella bakterier med hjälp av LAMP [76] (Fig. 4a).När optimerad LAMP användes i analysen var förhållandet mellan fluorescenssignal och brus ungefär 5-faldigt och detektionsgränsen nådde 7,2 kopior/μl genomiskt DNA. Dessutom visualiserades förekomsten av fem vanliga matsmältningsbakteriella patogener, inklusive Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis och Vibrio parahaemolyticus, baserat på metoden på < 60 min. Dessutom visualiserades förekomsten av fem vanliga matsmältningsbakteriella patogener, inklusive Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis och Vibrio parahaemolyticus, baserat på metoden på < 60 min.Dessutom visualiserades närvaron av fem vanliga bakteriella patogener i matsmältningskanalen, inklusive Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis och Vibrio parahaemolyticus med denna metod på mindre än 60 minuter.此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 可 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 原体 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 河流 弧菌 和 副溶血性 副溶血性。。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 大 、 肠 氏 菌 、 和 副溶血 。。。 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 、 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 和 副溶血 。。。 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPDessutom visualiserades närvaron av fem vanliga bakteriella gastrointestinala patogener, inklusive Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius och Vibrio parahaemolyticus med denna metod på mindre än 60 minuter.
Fördelarna med LAMP i mikrofluidik inkluderar bland annat snabb respons och miniatyriserad detektion.Men på grund av reaktionstemperaturen (cirka 70°C) genereras aerosoler oundvikligen under LAMP, vilket resulterar i en hög falsk positiv frekvens.Analysspecificitet, primerdesign och temperaturkontroll måste också optimeras för LAMP.Dessutom är chipdesigner som implementerar multipla måldetektion på ett enda chip av stort värde och bör utvecklas.Dessutom är LAMP lämplig för multifunktionsdetektering integrerad i ett chip, vilket är av stor betydelse, men det finns fortfarande mycket utrymme för utveckling.
Den höga falska positiva frekvensen av LAMP kan delvis reduceras med RPA, eftersom den relativt låga reaktionstemperaturen (~37 ° C) resulterar i relativt få avdunstningsproblem [77].I RPA-systemet initierar två motsatta primrar DNA-syntes genom att binda till ett rekombinas och amplifiering kan slutföras inom 10 minuter [78,79,80,81].Därför är hela RPA-processen mycket snabbare än PCR eller LAMP.Under de senaste åren har mikrofluidisk teknologi visat sig ytterligare förbättra hastigheten och noggrannheten hos RPA [82,83,84].Till exempel, Liu et al.[85] utvecklade en mikrofluidisk integrerad lateralflödespolymerasrekombinasamplifieringsanalys för snabb och känslig detektering av SARS-CoV-2 genom att integrera omvänd transkriptions-RPA (RT-RPA) och ett universellt lateralt flödestestremsa-detektionssystem.i ett enda mikrofluidiskt system.Figur 4b).Detektionsgränsen är 1 kopia/µl eller 30 kopior/prov, och detektionen kan slutföras på cirka 30 minuter.Kong et al.har utvecklat en bärbar mikrofluidisk enhet.[86] använde kroppstemperatur och ett mobiltelefonbaserat fluorescensdetektionssystem för att snabbt och direkt detektera HIV-1-DNA med hjälp av RPA (Figur 4c).Den bärbara RPA-analysen detekterar 100 kopior/mL av målsekvensen inom 24 minuter, vilket visar stor potential för snabb diagnos av HIV-1-infekterade spädbarn i begränsade resurser.
Isotermisk förstärkning i point-of-care testing (POCT).Utveckling och produktion av spin och reaktion SlipChip.Efter plasmasvetsning sattes topp- och bottenspånen ihop med en uppsättning muttrar för att bilda det slutliga spånet (anpassat från [76]).b Schematisk beskrivning av MI-IF-RPA-systemet för COVID-19-detektering (anpassad från [85]).c Schematisk beskrivning av ett bärbart RPA-test för snabb detektering av HIV-1-DNA (anpassad från [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM karboxifluorescein, humant immunbristvirus HIV, RPA-rekombinaspolymerasförstärkning, LED-ljusemitterande diod, MI-IF-lågkomplex-polymeras-polymeras-integrad mikrobinaspolymeras Förstärkning
Mikrofluidbaserad RPA utvecklas snabbt, men kostnaden för chiptillverkning och reaktionsförbrukning är för hög och måste reduceras för att öka tillgängligheten för denna teknik.Dessutom kan den höga känsligheten hos RPA påverka amplifieringen av icke-specifika produkter, särskilt i närvaro av kontaminering.Dessa begränsningar kan påverka tillämpningen av RPA i mikrofluidsystem och förtjäna ytterligare optimering.Väldesignade primers och prober för olika mål behövs också för att förbättra genomförbarheten av RPA-baserade mikrofluidstrategier i POCT.
Cas13 och Cas12a har förmågan att slumpmässigt klyva nukleinsyror och kan därför utvecklas som detektions- och diagnostiska verktyg.Cas13 och Cas12a aktiveras vid bindning till mål-DNA respektive RNA.När det väl har aktiverats börjar proteinet att klyva andra närliggande nukleinsyror, varefter guide-RNA som riktar sig mot patogenspecifika nukleinsyror kan klyva släckta fluorescerande prober och frigöra fluorescens.Baserat på denna teori, Kellner et al.[87] utvecklade en Cas13-baserad metod [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], och Broughton et al.[88] utvecklade ett annat tillvägagångssätt baserat på Cas12a [CRISPR Trans Reporter riktad mot DNA-endonukleas (DTECR)].
På senare år har olika metoder för detektion av nukleinsyror baserade på CRISPR dykt upp [89, 90].Konventionella CRISPR-baserade metoder är ofta tidskrävande och arbetsintensiva på grund av flera procedurer inklusive nukleinsyraextraktion, amplifiering och CRISPR-detektion.Exponering av vätskor för luft kan öka risken för falskt positiva resultat.Med tanke på ovanstående är CRISPR-baserade system i stort behov av optimering.
En pneumatiskt styrd mikrofluidisk plattform som kan utföra 24 analyser parallellt har utvecklats för CRISPR-Cas12a och CRISPR-Cas13a detektionstillämpningar [91].Systemet är utrustat med en fluorescensdetektionsanordning som kringgår nukleinsyraamplifiering och automatiskt detekterar femtomolära DNA- och RNA-prover.Chen et al.[92] integrerad rekombinasförstärkning med CRISPR-Cas12a-systemet i centrifugalmikrofluidik (Fig. 5a).Detta arbete övervinner svårigheten att integrera dessa två processer eftersom Cas12a kan smälta budbärar-DNA och hämma amplifieringsprocessen.Dessutom har Chen et al.[92] förlagrade dessutom reaktionsreagensen i en centrifugal mikrofluidisk kontroll för att automatiskt slutföra hela processen.I ett annat arbete har Silva et al.[93] utvecklade en diagnostisk metod utan CRISPR/Cas12a-förstärkning och en smartphone för att detektera SARS-CoV-2 (Fig. 5b).Denna analys, känd som ett mobiltelefonbaserat amplifieringsfritt system, inkluderar ett CRISPR/Cas-beroende enzym som är baserat på smartphonevisualisering av katalasgenererade bubbelsignaler i mikrofluidkanaler.Känslig detektion av mindre än 50 kopior/µl nukleinsyra utan pre-amplifiering, hela processen från provinjektion till signalavläsning tar bara 71 minuter.
Nukleinsyradetekteringsmetoder baserade på CRISPR.Centrifugal POCT för integrerad molekylär diagnostik baserad på CRISPR (anpassad från [92]).b Utveckling av CASCADE-testet för smartphone-baserad analys av SARS-CoV-2 (anpassat från [93]).RAA-rekombinasförstärkning, PAM angränsande protospacer-motiv, CRISPR-klustrade korta palindromiska upprepningar med jämna mellanrum, CASCADE-system utan mobiltelefonförstärkning med CRISPR/CAS-beroende enzymer, 1-etyl-3-[3-dimetylaminopropyl]karbodiimidhydroklorid EDC
Som det sista steget i nukleinsyradetektering återspeglar signaldetektering direkt diagnostiska resultat och är en kritisk faktor i utvecklingen av en effektiv, känslig och exakt POCT.Signaler kan läsas med olika metoder såsom fluorescerande, elektrokemiska, kolorimetriska och magnetiska strategier.I det här avsnittet beskriver vi logiken för varje tillvägagångssätt och jämför den molekylära diagnostiken av infektionssjukdomar i mikrofluidik.
Fluorescensbaserade strategier används i stor utsträckning för POCT-diagnostik av infektionssjukdomar på grund av deras anmärkningsvärda fördelar med utmärkt känslighet, låg kostnad, enkel operation och point-of-care-analys [94, 95].Dessa strategier använder märkta fluoroforer såsom fluorescerande färgämnen och nanomaterial för att skapa en detekterbar signal (fluorescensförbättring eller släckning).Detta fynd tyder på att fluorescensbaserade strategier kan delas in i direkt fluorescerande märkning, signal-på och signal-off fluorescerande detektion [96].Direkt fluorescerande märkningsdetektion använder speciella fluorescerande märkningar för att märka specifika ligander som genererar en specifik mängd fluorescens när de selektivt binds till ett mål.För signalbaserad fluorescensdetektion är kvaliteten på den fluorescerande signalen positivt relaterad till storleken av intresse.Fluorescensintensiteten är försumbar i frånvaro av ett mål och kan detekteras när en tillräcklig mängd mål är närvarande.Omvänt är intensiteten av fluorescens som detekteras av "signal-off" fluorescens omvänt proportionell mot mängden mål, initialt når ett maximalt värde och minskar gradvis när målet förstoras.Till exempel, genom att använda CRISPR-Cas13a målberoende trans-klyvningsmekanism, Tian et al.[97] utvecklade en ny igenkänningsstrategi för att upptäcka RNA som går förbi omvänd transkription direkt (Fig. 6a).Vid bindning till komplementära mål-RNA kan CRISPR-Cas13-RNA-komplexet aktiveras, vilket utlöser transkollateral klyvning av icke-specifika reporter-RNA.Den fluorescensmärkta reportern [fluorofor (F)] släcks av quenchern (Q) intakt och fluorescerar när den klyvs av det aktiverade komplexet.
Fördelen med elektrokemisk detektering är hög detekteringshastighet, enkel produktion, låg kostnad, lätt att bära och automatisk kontroll.Det är en kraftfull analysmetod för POCT-applikationer.Baserat på grafenfälteffekttransistorer Gao et al.[98] utvecklade en nanobiosensor för multiplexdetektering av borreliaantigener från Borrelia burgdorferi-bakterier med en detektionsgräns på 2 pg/ml (Fig. 6b).
Kolorimetriska analyser har använts i POCT-applikationer och drar nytta av fördelarna med portabilitet, låg kostnad, enkel förberedelse och visuell avläsning.Kolorimetrisk detektion kan använda oxidation av peroxidas eller peroxidasliknande nanomaterial, aggregering av nanomaterial och tillägg av indikatorfärgämnen för att omvandla information om närvaron av målnukleinsyror till synliga färgförändringar [99, 100, 101].Noterbart är att guldnanopartiklar används i stor utsträckning i utvecklingen av kolorimetriska strategier, och på grund av deras förmåga att inducera snabba och signifikanta färgförändringar finns det ett ökande intresse för utvecklingen av POCT kolorimetriska plattformar för in situ-diagnostik av infektionssjukdomar [102].Med en integrerad centrifugal mikrofluidikanordning [103] kan livsmedelsburna patogener i kontaminerade mjölkprover automatiskt detekteras på nivån av 10 bakterieceller, och resultaten kan avläsas visuellt inom 65 minuter (Fig. 6c).
Magnetiska avkänningstekniker kan noggrant detektera analyter med hjälp av magnetiska material, och det har funnits ett betydande intresse för POCT-applikationer under de senaste decennierna.Magnetiska avkänningstekniker har några unika fördelar såsom lågkostnadsmagnetiska material snarare än dyra optiska komponenter.Användningen av ett magnetfält förbättrar dock detektionseffektiviteten och minskar provberedningstiden [104].Dessutom visar resultaten av magnetisk sondering hög specificitet, känslighet och högt signal-till-brusförhållande på grund av den obetydliga magnetiska bakgrundssignalen från biologiska prover [105].Sharma et al.integrerade en magnetisk tunnelövergångsbaserad biosensor i en bärbar mikrochipplattform.[106] för multiplexdetektering av patogener (Fig. 6d).Biosensorer upptäcker känsligt subnanomolära nukleinsyror isolerade från patogener.
Typisk signaldetekteringsmetod.Konceptet med hyperlokaliserad detektion av Cas13a (anpassad från [97]).b Grafen nanobiosensor FET i kombination med Lyme GroES scFv (anpassad från [98]).c Kolorimetriska indikationer för multiplexdetektering av livsmedelsburna patogener i ett centrifugalmikrofluidchip: nr 1 och nr 3 prover med målpatogener, och nr 2, nr 4 och nr 5 prover utan målpatogener (anpassad från [103]) .d Biosensor baserad på en magnetisk tunnelövergång, inklusive en plattform, en inbyggd blockeringsförstärkare, en styrenhet och en strömförsörjning för signalgenerering/insamling (anpassad från [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS dimetikon, PMMA polymetylmetakrylat
Trots de utmärkta egenskaperna hos ovanstående detektionsmetoder har de fortfarande nackdelar.Dessa metoder jämförs (tabell 1), inklusive några applikationer med detaljer (för- och nackdelar).
Med utvecklingen av mikrofluidik, mikroelektromekaniska system, nanoteknik och materialvetenskap, går användningen av mikrofluidikchips för att upptäcka infektionssjukdomar ständigt framåt [55,96,107,108].Exakt hantering av miniatyrutrustning och vätskor bidrar till diagnostisk noggrannhet och kostnadseffektivitet.För vidare utveckling har därför ansträngningar gjorts för att optimera och uppgradera chipsen, vilket resulterat i olika mikrofluidchip med olika strukturer och funktioner.Här introducerar vi kortfattat flera vanliga typer av mikrofluidiska plattformar och jämför deras egenskaper (för- och nackdelar).Dessutom fokuserar de flesta av exemplen nedan i första hand på att bekämpa SARS-CoV-2.
LOCC är de vanligaste miniatyriserade komplexa analytiska systemen och deras operationer är mycket miniatyriserade, integrerade, automatiserade och parallelliserade från provinjektion och beredning, flödeskontroll och vätskedetektering [109, 110].Vätskor manipuleras genom noggrant utformad geometri och samverkan mellan många fysiska effekter såsom tryckgradienter, kapillärverkan, elektrodynamik, magnetfält och akustiska vågor [111].LOCC visar utmärkta fördelar inom screening med hög genomströmning och multipeldetektion, med snabb analyshastighet, liten provstorlek, låg strömförbrukning och hög hanterings- och drifteffektivitet;LOCC-enheter är dock mycket känsliga, och tillverkning, förpackning och gränssnitt.Men multiplexering och återanvändning möter enorma svårigheter [96].Jämfört med andra plattformar har LOCC unika fördelar vad gäller maximal applikationsdiversitet och bästa teknologikompatibilitet, men dess nackdelar är också uppenbara, nämligen hög komplexitet och dålig repeterbarhet.Beroendet av externa pumpar, som ofta är skrymmande och dyra, begränsar ytterligare deras användning i POCT.
Under covid-19-utbrottet fick LOCC mycket uppmärksamhet.Samtidigt finns det flera nya chips som kombinerar flera teknologier.Till exempel används smartphones nu i stor utsträckning som bärbara analysenheter och har stor potential för LOCC-integration.Sun et al.[21] tillverkade ett mikrofluidchip som tillåter multiplexering av specifika nukleinsyrasekvenser av fem patogener, inklusive SARS-CoV-2, med hjälp av LAMP och analyserade dem med en smartphone inom 1 timme efter reaktionens slut.Som ett annat exempel, Sundah et al.[112] skapade en molekylär switch [katalytisk amplifiering genom molecular transition state switch (CATCH)] för direkt och känslig detektering av SARS-CoV-2 RNA-mål med hjälp av smartphones. CATCH är kompatibel med bärbar LOCC och uppnår överlägsen prestanda (ungefär 8 RNA-kopior/μl; < 1 timme vid rumstemperatur) [112]. CATCH är kompatibel med bärbar LOCC och uppnår överlägsen prestanda (ungefär 8 RNA-kopior/μl; < 1 timme vid rumstemperatur) [112]. CATCH совместим с портативным LOCC och обеспечивает превосходную производительность (примерно 8 копий РНЕНЕН 1 копий РНН/1мкра; CATCH är kompatibel med bärbar LOCC och ger utmärkt genomströmning (ungefär 8 RNA-kopior/µl; < 1 timme vid rumstemperatur) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小温下< 1 尀温） CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小温下< 1 尀温） CATCH совместим с портативными LOCC och обладает превосходной производительностью (примерно 8 копий РНКа/1 примерно РНК/1 примки РНК/1мкл; CATCH är kompatibel med bärbara LOCC och har utmärkt prestanda (ungefär 8 RNA-kopior/µl; < 1 timme vid rumstemperatur) [112].Dessutom använder LOCC-enheter för molekylär diagnostik också vissa drivkrafter som vakuum, sträckning och elektriska fält.Kang et al.[113] demonstrerade en ultrasnabb nanoplasma-på-ett-chip-PCR i realtid för snabb och kvantitativ diagnos av COVID-19 i fält med hjälp av ett vakuumplasmoniskt flytande PCR-chip.Li et al.[114] utvecklade därefter ett sträckdrivet mikrofluidchip som möjliggjorde diagnosen covid-19.Plattformen använder RT-LAMP amplifieringssystemet för att avgöra om ett prov är kvalitativt positivt eller negativt.Därefter har Ramachandran et al.[115] uppnådde lämpliga elektriska fältgradienter med isotachofores (ITP), en selektiv jonfokuseringsteknik implementerad i mikrofluidik.Med ITP kan mål-RNA från råa nasofaryngeala pinnprover renas automatiskt.Sedan Ramachandran et al.[115] Genom att kombinera denna ITP-rening med ITP-förstärkta LAMP- och CRISPR-analyser upptäcktes SARS-CoV-2 i humana nasofaryngeala pinnprover och kliniska prover på cirka 35 minuter.Dessutom dyker det ständigt upp nya idéer.Jadhav et al.[116] föreslog ett diagnostiskt schema baserat på ytförstärkt Raman-spektroskopi i kombination med en mikrofluidisk enhet som innehåller antingen vertikalt orienterade guld/silverbelagda kolnanorör eller elektrospunnna mikro/nanorör för engångsbruk.Membranfunktionaliserade inbyggda filtermikrokanaler är engångsbruk.Enheten adsorberar virus från olika kroppsvätskor/utsöndringar som saliv, nasofarynx och tårar.Således är virustitern riklig och viruset kan noggrant identifieras med Raman-signaturen.
LOAD är en centrifugalmikrofluidisk plattform där alla processer styrs av ett frekvensprotokoll som roterar ett mikrostrukturerat substrat [110].LOAD-anordningen kännetecknas av att använda centrifugalkraften som en viktig drivkraft.Vätskor är också föremål för kapillär-, Euler- och Corioliskrafter.Med hjälp av en centrifuganordning utförs analyser i kontinuerlig vätskedrift från ett radiellt inåt till det yttre, vilket eliminerar behovet av ytterligare externa slangar, pumpar, ställdon och aktiva ventiler.Kort sagt, en enda kontrollmetod förenklar driften.Krafterna som verkar på vätskan i samma mikrofluidkanal på samma avstånd från belastningscentrumet är lika, vilket gör det möjligt att upprepa kanalstrukturen.Således är LOAD-utrustning enklare och mer ekonomisk att designa och tillverka än konventionell LOCC-utrustning, samtidigt som reaktionerna i stort sett är oberoende och parallelliserade;På grund av den höga mekaniska hållfastheten hos centrifugalutrustning är det emellertid begränsat tillgängligt spånmaterial och små volymer är svåra.till bilen.Samtidigt är de flesta LOAD-enheter designade för endast engångsbruk, vilket är dyrt för storskalig detektering [96, 117, 118, 119].
Under de senaste decennierna har LOAD, som anses vara en av de mest lovande mikrofluidenheterna, fått stor uppmärksamhet från forskare och tillverkare.Således har LOAD fått bred acceptans och har använts för molekylär diagnostik av infektiösa patogener [120, 121, 122, 123, 124], särskilt under utbrottet av covid-19.Till exempel i slutet av 2020, Ji et al.[60] visade en direkt RT-qPCR-analys för snabb och automatiserad parallell detektering av SARS-CoV-2 och influensa A- och B-infektioner i svalgprover.Sedan Xiong et al.[74] presenterade en LAMP-integrerad diskoid mikrofluidisk plattform för snabb, exakt och samtidig upptäckt av sju mänskliga luftvägskoronavirus, inklusive SARS-CoV-2, inom 40 minuter.I början av 2021, de Oliveira et al.[73] demonstrerade ett polystyrentonercentrifugalmikrofluidchip, manuellt manövrerat med en fingertoppsrotator, för RT-LAMP molekylär diagnos av COVID-19.Därefter har Dignan et al.[39] presenterade en automatiserad bärbar centrifugmikroenhet för rening av SARS-CoV-2-RNA direkt från buckala pinnprovssnitt.Medved et al.[53] föreslog ett inline SARS-CoV-2 aerosolprovtagningssystem med ett roterande mikrofluidiskt fluorescerande chip med liten volym med en detektionsgräns på 10 kopior/μL och en minsta cykeltröskel på 15 minuter.Suarez et al.[75] rapporterade nyligen utvecklingen av en integrerad modulär centrifugalmikrofluidisk plattform för direkt detektering av SARS-CoV-2 RNA i värmeinaktiverade nasofaryngeala pinnprover med hjälp av LAMP.Dessa exempel visar de stora fördelarna och löftet med LOAD i den molekylära diagnostiken av COVID-19.
År 1945 presenterade Muller och Clegg [125] först mikrofluidkanaler på papper med hjälp av filterpapper och paraffin.2007 skapade Whitesides-gruppen [126] den första funktionella pappersplattformen för protein- och glukostestning.Papper har blivit ett idealiskt substrat för mikrofluidik.Papperet har inneboende egenskaper såsom hydrofilicitet och porös struktur, utmärkt biokompatibilitet, låg vikt, flexibilitet, vikbarhet, låg kostnad, enkel användning och bekvämlighet.Klassiska µPADs består av hydrofila/hydrofoba strukturer byggda på papperssubstrat.Beroende på den tredimensionella strukturen kan μPADs delas in i tvådimensionella (2D) och tredimensionella (3D) μPADs.2D µPADs produceras genom att bilda hydrofoba gränser för att bilda mikrofluidiska kanaler, medan 3D µPADs vanligtvis tillverkas av staplar av lager av 2D mikrofluidiskt papper, ibland genom pappersvikning, sliptekniker, öppna kanaler och 3D-utskrift [96].Vattenhaltiga eller biologiska vätskor på μPAD styrs främst av kapillärkraft utan extern strömkälla, vilket underlättar förlagring av reagenser, provhantering och multiplexdetektering.Noggrann flödeskontroll och multiplexdetektering hämmas dock av otillräcklig detekteringshastighet, känslighet och återanvändbarhet [96, 127, 128, 129, 130].
Som en ovanlig mikrofluidisk plattform har μPAD i stor utsträckning främjats och utvecklats för molekylär diagnos av infektionssjukdomar som HCV, HIV och SARS-CoV-2 [131, 132].För selektiv och känslig detektion av HCV, Tengam et al.[133] utvecklade en ny biosensor baserad på fluorescerande papper med användning av en mycket specifik nukleinsyrasond baserad på pyrrolidinylpeptid.Nukleinsyror immobiliseras kovalent på partiellt oxiderat cellulosapapper genom reduktiv alkylering mellan aminogrupper och aldehydgrupper, och detektion är baserad på fluorescens.Dessa signaler kan läsas av en specialtillverkad pryl med en bärbar lysrörskamera i kombination med en mobiltelefonkamera.Därefter har Lu et al.[134] designade en pappersbaserad flexibel elektrod baserad på nickel/guld nanopartiklar/kolnanorör/polyvinylalkohol organometalliska ramverkskompositer för HIV-måldetektion genom DNA-hybridisering med metylenblått som en DNA-redoxindikator.På senare tid har Chowdury et al.[135] presenterade en hypotetisk plattformsdesign för point-of-care µPAD-testning med rå patientsaliv i kombination med LAMP och bärbar avbildningsteknik för covid-19 analytdetektion.
Laterala flödestester styr vätskor genom kapillärkrafter och kontrollerar vätskerörelser genom vätbarheten och egenskaperna hos porösa eller mikrostrukturerade substrat.Sidoflödesanordningarna består av prov, konjugat, inkubator och detektion, och absorberande dynor.Nukleinsyramolekylerna i LFA känner igen specifika bindemedel som är förlagrade vid bindningsstället och binder som komplex.När vätskan passerar genom inkubations- och detektionsplattorna fångas komplexen av infångningsmolekylerna som finns på test- och kontrolllinjerna, vilket visar resultat som kan avläsas direkt för blotta ögat.Vanligtvis kan LFA slutföras på 2-15 minuter, vilket är snabbare än traditionell upptäckt.På grund av den speciella mekanismen kräver LFA få operationer och kräver ingen extra utrustning, vilket gör den mycket användarvänlig.Det är lätt att tillverka och miniatyrisera, och kostnaden för pappersbaserade substrat är lägre.Den används dock endast för kvalitativ analys, och kvantitativ detektion är mycket svår, och multiplexeringsförmågan och genomströmningen är mycket begränsad, och endast en tillräcklig nukleinsyra kan detekteras åt gången [96,110,127].
Även om de flesta tillämpningar av LFA är fokuserade på immunanalyser, är användningen av LFA för molekylär diagnostik i mikrofluidchip också effektiv och populär [136].När det gäller hepatit B-virus, HIV och SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] föreslog en LFA-plattform för uppkonvertering av nanopartiklar och visade mångsidigheten hos denna miniatyriserade och portabla plattform genom känslig och kvantitativ detektion av flera mål som HBV-nukleinsyra.Dessutom har Fu et al.[138] visade en ny LFA baserad på ytförstärkt Raman-spektroskopi för kvantitativ analys av HIV-1-DNA vid låga koncentrationer.För snabb och känslig detektion av SARS-CoV-2, Liu et al.[85] utvecklade en mikrofluidikintegrerad RPA-lateralflödesanalys genom att kombinera RT-RPA och ett universellt lateralt flödesdetektionssystem till ett enda mikrofluidsystem.
Användningen av olika mikrofluidiska plattformar varierar beroende på specifika studier, och drar full nytta av plattformarnas möjligheter och fördelar.Med prisvärda ventiler, pumpar och kanaler är LOCC den mest omfattande plattformen för applikationsmångfald och interoperabilitet med största utrymme för utveckling.Därför hoppas och rekommenderar vi att de senaste studierna genomförs på LOCC som ett första försök och att förutsättningarna optimeras.Dessutom förväntas effektivare och noggrannare metoder upptäckas och användas i systemet.LOAD utmärker sig i exakt kontroll av vätskor från befintliga LOCC-enheter och uppvisar unika fördelar i enstaka drivenheter genom centrifugalkraft utan behov av externa enheter, medan parallella svar kan vara separata och synkroniserade.Således kommer LOAD i framtiden att bli den huvudsakliga mikrofluidiska plattformen med färre manuella operationer och mer mogen och automatiserad teknologi.µPAD-plattformen kombinerar fördelarna med LOCC och pappersbaserade material för låg kostnad, engångsdiagnostik.Därför bör framtida utveckling fokusera på bekväma och väletablerade tekniker.Dessutom är LFA väl lämpad för upptäckt med blotta ögat, och lovar att minska provförbrukningen och påskynda detektionen.En detaljerad plattformsjämförelse visas i tabell 2.
Digitala analyser delar in provet i många mikroreaktorer, som var och en innehåller ett diskret antal målmolekyler [139, 140].Digitala analyser erbjuder betydande fördelar för att utföra absolut kvantifiering genom att utföra tusentals parallella biokemiska experiment samtidigt och individuellt i mikronskala fack snarare än i en kontinuerlig fas.Jämfört med traditionell mikrofluidik kan kompartmentreaktioner minska provvolymen, öka reaktionseffektiviteten och enkelt integreras med andra analytiska metoder utan behov av kanaler, pumpar, ventiler och kompakta konstruktioner [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147].Följande två metoder används i digitala analyser för att uppnå enhetlig och exakt separation av lösningar, inklusive reagens och prover såsom celler, nukleinsyror och andra partiklar eller molekyler: (1) droppemulsioner som utnyttjar vätskegränsytans instabilitet;(2) arraydelning utförs av anordningens geometriska begränsningar.I den första metoden kan droppar som innehåller reagens och prover i mikrokanaler skapas genom passiva metoder som medström, tvärflöde, flödesfokusering, stegvis emulgering, mikrokanalemulgering och membran genom viskösa skjuvkrafter och emulgering med kanalbyte.lokalisering [143, 145, 146, 148, 149] eller med aktiva metoder [150, 151], som inför ytterligare energi genom elektrisk, magnetisk, termisk och mekanisk styrning.I det senare tillvägagångssättet delas den bästa vätskevolymens enhetlighet i mikrofluidiska kammare genom att hålla rumsliga strukturer av samma storlek, såsom mikrogropar och ytmatriser [152, 153, 154].Särskilt är droppar stora flödessektioner som också kan genereras och manipuleras på elektroduppsättningar baserade på digital mikrofluidik (DMF).Elektrovätning av dielektrika är en av de bäst studerade DMF-teorierna, eftersom elektrovätning av dielektrikum tillåter exakt manipulering av individuella droppar, styr formen på vätskan och asymmetriska elektriska signaler som passerar genom olika sidor [141, 144].De huvudsakliga operationerna med droppar i DMF inkluderar sortering, splittring och sammanslagning [151, 155, 156], som kan tillämpas inom olika analysområden, särskilt vid molekylär detektion [157, 158, 159].
Digital nukleinsyradetektering är en tredje generationens molekylär diagnostisk teknologi efter konventionell PCR och kvantitativ realtids-PCR (qPCR), parallellt med sekvensering med hög genomströmning och flytande biopsi.Under de senaste två decennierna har digitala nukleinsyror snabbt utvecklats inom området molekylär diagnostik av infektiösa patogener [160, 161, 162].Absolut kvantifiering av digital nukleinsyradetektion börjar med att packa prover och reagens i individuella fack för att säkerställa att varje målsekvens har samma sannolikhet att komma in i varje enskild avdelning.Teoretiskt kan varje sektion tilldelas flera målsekvenser, eller så kanske det inte finns ett oberoende mikroreaktionssystem.Genom de olika avkänningsmekanismerna som beskrivs ovan kan fack med mikrobiella målsekvenser som genererar signaler över ett visst tröskelvärde visualiseras med blotta ögat eller av en maskin och märkas som positiva, medan andra fack som genererar signaler under tröskeln märks som positiva .negativa, vilket gör signalen för varje sektion till en boolesk.Genom att beräkna antalet skapade fack och frekvensen av positiva resultat efter reaktionen kan de ursprungliga kopiorna av testproven matchas med hjälp av Poisson-fördelningsformeln utan behov av en standardkurva, vilket krävs för rutinmässiga kvantitativa analyser som t.ex. som qPCR.[163] Jämfört med traditionella molekylära diagnostiska metoder har digital nukleinsyradetektion en högre grad av automatisering, högre analyshastighet och känslighet, färre reagenser, mindre kontaminering och enklare design och tillverkning.Av dessa skäl har användningen av digitala analyser, särskilt droppbaserade metoder, för molekylär diagnostik, som kombinerar amplifierings- och signalavläsningstekniker, studerats väl under det kritiska utbrottet av SARS-CoV-2.Till exempel, Yin et al.[164] kombinerade droppdigitala och snabba PCR-metoder för att detektera ORF1ab-, N- och RNase P-gener i SARS-CoV-2 i ett mikrofluidiskt chip.Noterbart kunde systemet identifiera en positiv signal inom 115 sekunder, vilket är snabbare än konventionell PCR, vilket indikerar dess effektivitet vid punkt-of-care-detektion (Figur 7a).Dong et al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] och Alteri et al.[167] tillämpade också droplet digital PCR (ddPCR) för att detektera SARS-CoV-2 i ett mikrofluidiskt system med imponerande resultat.För att ytterligare förbättra detektionshastigheten, Shen et al.[168] uppnådde ddPCR-baserad chipavbildning på så lite som 15 sekunder utan användning av bildsömnadstekniker, vilket påskyndade ddPCR-teknikprocessen från labb till applikation.Inte bara termiska amplifieringsmetoder som PCR används, utan även isotermiska amplifieringsmetoder används för att förenkla reaktionsförhållanden och snabb respons.Lu et al.[71] utvecklade SlipChip för droppanalys, som kan generera droppar av olika storlekar vid höga densiteter i ett steg och kvantifiera SARS-CoV-2-nukleinsyror med hjälp av digital LAMP (Figur 7b).Som en snabbt utvecklande teknologi kan CRISPR också spela en viktig roll i digital nukleinsyradetektering genom bekväm kolorimetrisk avbildning utan behov av ytterligare nukleinsyrafärgningar.Ackerman et al.utvecklat en kombinatorisk matrisreaktion för multiplexutvärdering av nukleinsyror.[158] upptäckte 169 humanassocierade virus, inklusive SARS-CoV-2, i droppar innehållande CRISPR-Cas13-baserade nukleinsyradetekteringsreagenser i en mikrobrunnsanalys (Figur 7c).Dessutom kan isotermisk förstärkning och CRISPR-teknik användas i samma system för att kombinera fördelarna med båda.Park et al.[169] En digital CRISPR/Cas12a-analys utvecklades i ett kommersiellt mikrofluidchip för detektering av extraherad och värmedödad SARS-CoV-2 baserat på en enstegs RT-RPA med en kortare och högre signal-till-bakgrundsdetektering tidsförhållande., bredare dynamiskt område och bättre känslighet (fig. 7d).Några beskrivningar av dessa exempel ges i tabell 3.
Typisk digital plattform för nukleinsyradetektion.a Det snabba digitala PCR-arbetsflödet består av fyra nyckelsteg: provberedning, distribution av reaktionsblandningen, amplifieringsprocess och målkvantifiering (anpassad från [164]).b Schematisk bild som visar analys av SlipChip-droppar för droppbildning vid hög densitet (anpassad från [71]).c CARMEN-Cas arbetsflödesdiagram13 (anpassad från [158]).d Översikt över avancerad digital virusdetektion med CRISPR/Cas i en pott (anpassad från [169]).Utan vatten-i-olja, polydimetylsiloxan PDMS, PCR-polymeraskedjereaktion, DAQ-datainsamling, PID-proportionellt integrerat derivat, CARMEN kombinatorisk matrisreaktion för multiplex nukleinsyrautvärdering, SARS-CoV-2, allvarligt akut respiratoriskt syndrom, coronavirus 2 , RT-amplifiering av omvänt transkriptas-rekombinaspolymeras-RPA, S/B-signal i bakgrunden
Posttid: 15 september 2022
